基于受激拉曼散射顯微鏡的高靈敏度無標(biāo)記生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)背景：因?yàn)楦鞣N化學(xué)鍵有其特征頻率袭灯，使得基于紅外吸收和拉曼散射的振動(dòng)顯微術(shù)可被用作為無標(biāo)記對(duì)比度機(jī)制。然而使用長波長的紅外顯微鏡的分辨率不夠绑嘹，使用短激發(fā)波長的自發(fā)拉曼散射顯微鏡盡管有高分辨率妓蛮，但是其靈敏度不夠，成像速度不足圾叼。相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering,CARS)顯微鏡的靈敏度要高于自發(fā)拉曼散射顯微鏡，但是因?yàn)榉枪舱癖尘暗拇嬖谵囫拗屏似涮綔y靈敏度夷蚊。受激拉曼散射(stimulated raman scattering,SRS)于1968年初次觀測到，隨后在許多光譜研究中得到廣 ...
髓介。反斯托克斯拉曼散射不存在熒光問題惕鼓，因?yàn)榕c激發(fā)波長相比，反斯托克斯拉曼散射是藍(lán)移的唐础，因此在光譜中與熒光自然分離箱歧。當(dāng)用可見光激發(fā)時(shí)，熒光本底問題更為嚴(yán)重一膨。拉曼光譜中的強(qiáng)熒光信號(hào)直接影響拉曼測量的準(zhǔn)確性和靈敏度呀邢。熒光和自發(fā)拉曼信號(hào)在波長維度上重疊，因此不能用簡單的濾光片分離豹绪。幸運(yùn)的是价淌，它們?cè)谝韵滦再|(zhì)上有所不同，這是許多拉曼測量中熒光抑制方法的基礎(chǔ)：1.熒光發(fā)射壽命(納秒量級(jí))遠(yuǎn)長于拉曼散射壽命(皮秒量級(jí))瞒津。這一原理產(chǎn)生了各種時(shí)域方法蝉衣，其中一個(gè)超快脈沖激光器用于激勵(lì)，可應(yīng)用于時(shí)域拉曼光譜系統(tǒng)巷蚪，需要注意的是病毡，激光脈沖不應(yīng)該太短，因?yàn)樾∮?ps的脈沖不太單色屁柏，這會(huì)導(dǎo)致光譜分辨率的嚴(yán)重?fù)p失啦膜。超快光脈沖序列 ...
光脈沖、發(fā)射拉曼散射信號(hào)和發(fā)射熒光的時(shí)間輪廓前联。熒光過程包括激發(fā)功戚、內(nèi)部轉(zhuǎn)換和發(fā)射三個(gè)重要步驟，每個(gè)步驟都發(fā)生在不同的時(shí)間尺度上似嗤。首先啸臀，入射光子激發(fā)熒光團(tuán)分子的時(shí)間為飛秒(10-15秒)量級(jí)。其次，振動(dòng)弛豫的無輻射內(nèi)轉(zhuǎn)換過程也非吵肆＃快豌注，在10-14 ~ 10-11 s之間。最后灯萍，熒光發(fā)射是一個(gè)緩慢的過程轧铁，大約發(fā)生在10-9-10-7 s左右。熒光壽命是指分子在發(fā)射熒光光子前處于激發(fā)態(tài)的平均時(shí)間旦棉。圖1所示的指數(shù)衰減曲線說明了熒光發(fā)射時(shí)間的統(tǒng)計(jì)分布齿风。單熒光團(tuán)的熒光時(shí)間輪廓符合壽命常數(shù)τ的指數(shù)函數(shù)，而拉曼發(fā)射幾乎與激發(fā)激光同時(shí)發(fā)生绑洛。由于拉曼信號(hào)比熒光信號(hào)的發(fā)射速度快得多救斑，因此選擇合適的時(shí)間門寬度，原則上可 ...
和反斯托克斯拉曼散射）真屯，拉曼散射光強(qiáng)度大約是總散射光強(qiáng)度的10-7 脸候。正是這些波長改變了的拉曼散射光能夠給我們提供有關(guān)樣品的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)信息.來自分子的散射光有幾種成分：瑞利散射、斯托克斯和反斯托克斯拉曼散射.在分子體系中绑蔫，這些頻率主要是位于分子轉(zhuǎn)動(dòng)运沦、振動(dòng)以及電子能級(jí)躍遷相關(guān)的范圍內(nèi)。散射光沿著所有方向輻射配深，伴隨波長的變化携添，其偏振方向也有變化。1. 散射光頻率不發(fā)生改變的散射過程稱為瑞利散射凉馆，就是Lord Rayleigh用來解釋天空之所以呈現(xiàn)為藍(lán)色的那種過程薪寓。2. 散射光頻率（波長）發(fā)生改變的散射過程稱為拉曼散射，拉曼光子的能量與入射光子能量相比可以增大澜共，也可以變小向叉， 取決于分子的振動(dòng)態(tài)。 ...
正常范圍內(nèi)的拉曼散射本質(zhì)上是非相干的嗦董。但通過適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)(稱為q開關(guān))母谎，紅寶石激光器的發(fā)射可以在一個(gè)短的持續(xù)時(shí)間內(nèi)(10-8秒的量級(jí))和高的峰值功率(高達(dá)100兆瓦或更多)的單個(gè)“巨型脈沖”中獲得。當(dāng)如此強(qiáng)烈的相干光照射到樣品上時(shí)京革，就會(huì)觀察到全新的現(xiàn)象奇唤。正常拉曼效應(yīng)的量子力學(xué)理論變得不充分。受激拉曼效應(yīng)做同調(diào)拉曼散射時(shí)匹摇，試樣同時(shí)受兩雷射之照射咬扇，一作激發(fā)用(ωL)，一作監(jiān)控用(ωS)廊勃，而拉曼散射之強(qiáng)弱可用ωS之增益為測度懈贺。這些現(xiàn)象通常被稱為受激拉曼效應(yīng)经窖。在頻率vo的大脈沖激勵(lì)下，樣品在一定的Stokes頻率vo - v時(shí)產(chǎn)生增益梭灿，其中v是拉曼主動(dòng)振動(dòng)的頻率画侣。通常只有一個(gè)這樣的頻率是“活躍的”，即每 ...
干反斯托克斯拉曼散射顯微鏡已成為一種強(qiáng)大的技術(shù)堡妒，具有許多在生物醫(yī)學(xué)成像配乱、細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。如果泵浦源和斯托克斯場皮迟，分別以頻率ωp和ωs與拉曼活性分子相互作用,以并且頻率Ω=ωp-ωs發(fā)生共振搬泥，產(chǎn)生頻率為ωAS=2ωp-ωs的諧振反斯托克斯信號(hào)。這個(gè)信號(hào)允許對(duì)未染色樣品進(jìn)行化學(xué)選擇性成像伏尼。然而佑钾，這個(gè)信號(hào)也有不包含任何特定的化學(xué)信息的非共振信號(hào)的貢獻(xiàn)。這種非共振背景強(qiáng)度取決于采樣烦粒，非共振信號(hào)會(huì)使共振信號(hào)失真，甚至可以淹沒諧振信號(hào) 代赁。共振和非共振CARS響應(yīng)起源于來自三階磁化率扰她。在外向方向上檢測 CARS信號(hào)顯著降低了非共振型號(hào)的貢獻(xiàn)，因此提高了檢測靈敏度芭碍。盡管如此徒役，許多可以避免或消除CA ...
的斯托克斯-拉曼散射光子。拉曼光譜的校準(zhǔn)是通過使用汞氖 (Hg-Ne) 校準(zhǔn)源實(shí)現(xiàn)的窖壕。我們間隔不同培養(yǎng)時(shí)間分別從患癌組織和正常組織選取個(gè)別點(diǎn)獲取拉曼信號(hào)忧勿。圖1正常組織（a）和患癌組織（b）隨培養(yǎng)時(shí)間變化的拉曼光譜 如上圖顯示了大鼠正常 (圖 1.a) 和患癌 (圖 1.b) 組織的拉曼光譜變化。值得注意的是瞻讽，患癌組織的拉曼光譜的變化比正常乳房的拉曼光譜的變化要顯著得多鸳吸。例如，721 - 828 cm-1 的峰值在患癌組織中比正常組織增加更多速勇。在該區(qū)域晌砾，存在被報(bào)道為乳腺癌或乳腺癌相關(guān)峰的727cm-1（C-C拉伸）、780cm-1（核苷酸）烦磁、811cm-1（核苷酸）养匈、817cm-1（C-C拉伸 ...
聯(lián)照明的相干拉曼散射顯微鏡,可以打破散粒噪聲限制，提高信噪比都伪、靈敏度和成像速度呕乎。在對(duì)細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行成像時(shí)，信噪比提高了 35%陨晶。結(jié)合亞波長分辨率和高靈敏度(提升14%)猬仁，可以看到原本會(huì)被散粒噪聲掩埋的生物特征。利用量子關(guān)聯(lián)可以避免光致?lián)p傷。消除了相干拉曼顯微鏡和更廣泛的高性能顯微鏡進(jìn)一步發(fā)展的根本障礙逐虚。原理解析：（1）借助壓縮態(tài)光場的光學(xué)測量可以突破散粒噪聲極限聋溜，通過明亮壓縮光源與相干拉曼顯微鏡結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)突破散粒噪聲限制的成像效果叭爱。顯微鏡采取倒置結(jié)構(gòu)撮躁，集成了傳統(tǒng)明場成像和量子增強(qiáng)受激拉曼成像(如圖1a)。選用近紅外波長減小生物樣品的激光吸收和光損傷买雾。圖1a左為泵浦光生成部分把曼，中為受激拉曼散射 ...
光子是由稱為拉曼散射的非彈性散射過程產(chǎn)生的。雖然與瑞利散射光子相比漓穿，光子的數(shù)量相對(duì)較少嗤军，但這些光子的波長和強(qiáng)度攜帶有關(guān)特定化學(xué)鍵存在的定性和定量信息。在給定的拉曼光譜中晃危，出現(xiàn)在特定波數(shù)位置的一組峰可以被描述為識(shí)別特定化學(xué)物質(zhì)的“指紋”叙赚，同時(shí)，峰的高度可以與這種化學(xué)物質(zhì)的濃度有關(guān)僚饭。多組分分析是拉曼光譜的應(yīng)用之一震叮。在過去的二十年里，許多研究小組提出了光學(xué)拉曼裝置鳍鸵，專門設(shè)計(jì)來提高該技術(shù)測量多組分濃度的能力苇瓣。這些系統(tǒng)是專門設(shè)計(jì)的，以減少整體方法的錯(cuò)誤偿乖，這反過來允許增加所調(diào)查的混合物中分析物的數(shù)量击罪，以及降低可測量的特定化學(xué)品的濃度限制。圖1在這類的第1個(gè)實(shí)驗(yàn)中贪薪，使用如上圖1所示的基本拉曼設(shè)置來定量水溶液 ...
系統(tǒng)在典型的拉曼散射中媳禁，一束光被聚焦到樣品中。散射信號(hào)隨后由聚光鏡收集入分光儀画切，不同波長的拉曼峰被分光儀內(nèi)的光柵在空間上分隔開损话。在時(shí)域中這些峰通常被認(rèn)為是同時(shí)到達(dá)光譜儀。這種方法中拉曼信號(hào)通常被熒光輻射污染槽唾。通過對(duì)發(fā)射信號(hào)進(jìn)行時(shí)間門控丧枪，可以將拉曼信號(hào)從熒光背景中分離出來:如果短脈沖光激發(fā)分子，拉曼信號(hào)在脈沖的脈寬范圍內(nèi)發(fā)射庞萍，而熒光的壽命更長拧烦。根據(jù)這個(gè)想法可得到無熒光的拉曼光譜。但是儀器變得更復(fù)雜钝计，且由于通過門控系統(tǒng)和光譜儀不可避免的損耗恋博，信號(hào)的幅值顯著降低齐佳。此外通過光學(xué)元件，特別是光譜儀光柵的傳輸通常是偏振相關(guān)的债沮。新的拉曼信號(hào)的采集和分析方法解決了這兩個(gè)障礙:相對(duì)較弱的信號(hào)水平和不消失的熒光背 ...
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