博覽：2021 Light Sci Appl 近紅外成像窗口的完善和延伸

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博覽：2021 Light Sci Appl 近紅外成像窗口的完善和延伸

技術背景：

熒光成像已廣泛應用于醫(yī)療實踐兔综，隨著對光與生物組織相互作用認識的深入以及檢測技術成本的下降，熒光成像波長整體上從可見光區(qū)域不斷紅移到近紅外（NIR）區(qū)域狞玛。光在生物介質(zhì)中傳播時的能量損失可歸咎于吸收衰減和散射干擾软驰。吸收損耗決定了我們能否捕捉到信號，而散射信號總是降低圖像的清晰度为居。此外碌宴，生物組織過度吸收光可能會導致組織損傷蒙畴。一些生物分子的自發(fā)熒光總是與有用信號混合在一起贰镣，zui終成為拍攝圖像的背景。因此膳凝，光吸收和散射對熒光圖像采集完全有害的根深蒂固的信念促使大多數(shù)研究人員追求具有z小光子吸收和散射的完美窗口用于生物成像碑隆。基于第二近紅外窗口(NIR-II)的生物熒光成像被普遍公認為具有更小的光子散射蹬音，從而圖像質(zhì)量佳上煤。特別是檢測體內(nèi)的深層信號時更傾向于這種窗口選擇策略。

NIR-II窗口的定義一直被限制在1000-1700nm著淆，促使各種NIR發(fā)射器(emitters)的峰值發(fā)射波長超過1000 nm劫狠，甚至超過 1500 nm(NIR-IIb，1500-1700nm)永部。同時独泞，一些現(xiàn)有和正在開發(fā)的熒光團的峰值發(fā)射低于1000/1500 nm，但明亮的發(fā)射尾(即發(fā)射曲線的拖尾懦砂，不是峰值部分)超過1000/1500 nm，因此也非常適合NIR-II/NIR-IIb熒光成像组橄，這包括一些極好的聚集體探針(probes in aggregates)荞膘。目前來講，明亮的長波長近紅外發(fā)射器的設計和合成仍然充滿挑戰(zhàn)玉工。此外羽资，上述光吸收在 NIR-II 熒光成像中的積極作用可能會破壞超長發(fā)射器的特權，即遵班，成像波長越長削罩，成像性能不一定越好瞄勾。此外，有機藥劑(organic agents)一直被認為具有良好的生物相容性弥激，但實際上很難讓有機染料同時具備長波長和強發(fā)射。由于其發(fā)射拖尾通常占整體的一小部分愿阐，因此直接將藥劑應用于某些給定的長通（LP）光譜區(qū)域中的檢測并進行高對比度成像微服。但是，經(jīng)驗指導我們在確定成像窗口時要避開生物分子(如水)的光吸收峰缨历。因此以蕴，考慮到吸收的積極影響，仍需要仔細驗證用于成像的 LP 波段辛孵。

微小生物結構的顯微鏡檢查對于理解生物過程和診斷以及治療某些疾病是必不可少的丛肮。NIR-II窗口的熒光寬場顯微鏡展示其在嚙齒動物甚至非人類靈長類動物的生物組織中具有出色的深度成像能力。具有高時間分辨率的用戶友好的成像模式可以幫助操作員實時監(jiān)測血流等動態(tài)過程魄缚。然而宝与，散焦信號和散射光往往與目標信息一起被收集，從而成為強背景冶匹，并降低圖像對比度习劫。因此一些 NIR-II 顯微成像技術，如共聚焦和光片顯微鏡等被提出來嚼隘，旨在通過調(diào)整采集和激發(fā)模式來抵消圖像背景诽里。

當前不足：

如今，NIR-II熒光成像已經(jīng)用于臨床指導復雜的肝腫瘤手術谤狡。然而，光吸收的建設性作用在某種程度上似乎被忽視了卧檐。高質(zhì)量圖像的zui終采集往往是通過使用更長的波長墓懂，夸大其對散射抑制的積極效果，并認為同時產(chǎn)生的吸收會衰減有用的信號泄隔。而事實上拒贱，一些工作已經(jīng)揭示散射介質(zhì)中吸收引起的分辨率增強，這是由于背景信號經(jīng)歷了更長的光程佛嬉。然而逻澳，如何充分利用光吸收來選擇合適的熒光成像窗口仍未明確。

共聚焦和光片顯微鏡等與寬場顯微鏡相比暖呕，引入針孔的掃描共聚焦顯微鏡不可避免地浪費了有用的信號并延長了成像持續(xù)時間斜做。光片激發(fā)總是對樣品的透明度提出很高的要求。因此湾揽，仍然迫切需要時空分辨率高瓤逼、穿透力強笼吟、操作簡便的顯微鏡。

文章創(chuàng)新點：

基于此霸旗，浙江大學的Zhe Feng(第1作者),Jun Qian(通訊作者)等人考慮生物組織內(nèi)占很大比重的水的吸收作用贷帮，通過仿真和實驗證明吸收對背景信號衰減的積極作用不應該被忽視，并根據(jù)水的吸收峰诱告，重新完善并拓展了NIR窗口的劃分撵枢。

(1) 用蒙特卡羅方法模擬生物組織中的NIR光子傳播，并創(chuàng)新性地提出了1400-1500nm精居、1700-1880nm和2080-2340nm的良好成像性能锄禽，并定義為 NIR-IIx、近紅外 IIc (NIR-IIc) 和第三個近紅外 (NIR-III) 窗口靴姿。

(2) 借助硫化鉛 (PbS) 量子點 (QD) 具有高熒光亮度和可調(diào)發(fā)射波長的優(yōu)點沃但。設計并合成了一系列PbS/CdS核殼量子點(CSQD)，然后用聚乙二醇 (polythylene glycol,PEG)將它們水合佛吓。借助峰值發(fā)射波長為~1100宵晚、~1300 和~1450nm的明亮QD，發(fā)現(xiàn)水吸收峰周圍的檢測區(qū)域始終提供極大的圖像質(zhì)量坝疼，因此NIR-II窗口的定義被進一步完善為900–1880nm。

(3) 定義為NIR-IIx區(qū)域的1400-1500 nm被證明提供比NIR-IIb區(qū)域更出色的熒光圖像谆沃。體內(nèi)NIR-IIx熒光顯微腦血管成像展現(xiàn)出背景的強烈抑制钝凶，圖像對比度非常佳，成像深度達到~1.3 mm唁影，代表了迄今為止小鼠大腦中z深的體內(nèi)NIR-II熒光成像耕陷。

(4) 考慮到大量熒光團的發(fā)射峰值短于1400 nm，但保持明亮的發(fā)射拖尾据沈，建議有效使用1400nm LP成像哟沫，其性能優(yōu)于NIR-IIb區(qū)域。

原理解析：

(1) 由于散射光子比彈道光子在生物組織中的光程更長锌介，光吸收優(yōu)先消耗掉多次散射的光子嗜诀。如圖1所示，右圖組織的光吸收要強于左圖孔祸，產(chǎn)生了更強信號與背景比(SBR)的熒光圖像隆敢。

使用Mente Carlo方法仿真光子在組織中的傳播，目標物為一條線崔慧。當保持吸收系數(shù)不變拂蝎，散射系數(shù)越小，全半高寬越小(見圖2g)惶室，信號與背景的比值(signal-to-background ratio,SBR)越大温自。圖2a,b,c的散射系數(shù)分別為μs’ =?10?mm?1 ; μs’ = 3?mm?1 ; μs’ =?0.2?mm?1 玄货，吸收系數(shù)都為μa=0.3?mm?1。當散射系數(shù)保持不變悼泌，吸收系數(shù)越大松捉，全半高寬越小(見圖2g),SBR越大(見圖2h)。圖2d,e,f的μs’=1?mm?1,μa 分別為0.01, 0.1,和1?mm?1 馆里。

(2) 根據(jù)水在700-5000nm范圍內(nèi)的光譜吸收分布惩坑，完善近紅外區(qū)域的劃分。由于1700-1880nm與1500-1700nm有相似的吸收和散射特性也拜，以及980nm處有一個吸收峰，所以將NIR-II區(qū)完善為900-1880nm(一般為1000-1700nm趾痘，經(jīng)典的InGaAs探測器將光學成像限制在1700nm以內(nèi)),其中1700-1880nm為NIR-IIc，1400-1500n為NIR-IIx永票，1500-1700nm為NIR-IIb卵贱。由于2080nm和2340nm的吸收與1450nm處相似，將2080-2340nm劃分為NIR-III侣集。

水是生物體的主要組成部分键俱，在~980nm,~1200nm,~1450nm,~1930nm有吸收峰(如圖2i,j,k，j是k圖實線框的局部放大世分，i是j實線框的局部放大)编振，1930nm的峰值時1450nm處的e100，因此不適合用于深層組織探測臭埋。在水的吸收峰處檢測發(fā)射熒光能夠極大的提高成像質(zhì)量踪央，但是由于光熱損傷，具有強光吸收的窗口不適合做激發(fā)光瓢阴。如圖l-q畅蹂，考慮水的吸收和皮膚的散射特性，對上述劃分進行成像仿真荣恐，除了1880nm-2080nm由于極強吸收導致幾乎觀測不到任何東西外液斜，光吸收的增加和光子散射的減少可以明顯的提高成像質(zhì)量。圖2r為全半高寬叠穆，圖2s為SBR分析少漆。

實驗證明：

(1) 900-1000nm應該包含在NIR-II窗口內(nèi)。使用PEGylated 1100-Pbs/Cds QDs痹束，其在水中的發(fā)射光譜見圖3a检疫，發(fā)射譜范圍內(nèi)的積分強度見圖3b。雖然在生物組織內(nèi)900-1000nm相比1000-1100nm散射效應更強祷嘶，但是生物體內(nèi)的水在900-1000nm范圍內(nèi)有更強的吸收(見圖3c)屎媳。因此夺溢，可以從圖3g,e,d,h可以看到，在散射與吸收的綜合作用下烛谊，900-1000nm的成像效果不弱于1000-1100nm风响。更進一步分析，選取某一條局部的線來比較其SBR丹禀，可以知道900-1100nm甚至有略優(yōu)的SBR状勤，見圖3f、i双泪。

(2) 水對約1300 nm的不斷增加的光吸收“開啟”了 NIR-II 熒光成像的有前景的新階段 。利用Pbs/CdS CSQDs焙矛，其在水中的發(fā)射光譜見圖4a葫盼，發(fā)射譜范圍內(nèi)的積分強度見圖4b。計算的1300-1500nm的熒光強度略低于1100-1300nm 的熒光強度村斟，這可能歸咎于水的吸收贫导。從圖 4c 中可以明顯看出，從1100-1300nm到1300-1500nm的轉(zhuǎn)變不僅減少了光子散射蟆盹，而且顯著提高了光吸收孩灯，這將使得背景抑制得到明顯改善。見圖4d,e,g,h,j,k逾滥，活體小鼠熒光成像時峰档，1300-1500nm比1100-1300nm具有更清晰的圖像效果，圖4f,i,l量化的結果也表明其明顯具有更佳的SBR匣距。這證明了光吸收的顯著增長而不是遞減的光子散射決定了NIR-II熒光成像更有前景的階段的開始面哥。

(3) NIR-II成像窗口位于~1450nm處的強吸收峰附近 。利用PEGylated 1450-Pbs/CdS QDs,其在水和重水里的發(fā)射光譜見圖5a,其在水中的發(fā)射熒光光譜積分強度見圖5b毅待。水在~1450nm附近有強吸收峰1400-1500nm的NIR-IIx窗口和1425-1475nm包含了z強吸收峰尚卫。再一次實驗證明，強吸收能夠產(chǎn)生更好的SBR尸红，見圖d-q吱涉。而~1450nm附近由于水的強吸收，以往一直是被認為不適合成像外里。在這里證明不僅適合成像怎爵，而且成像質(zhì)量優(yōu)于NIR-IIb的熒光成像。

深穿透熒光宮腔造影具有無創(chuàng)盅蝗、空間分辨率高鳖链、無電離輻射等多種優(yōu)勢，為子宮異常和宮內(nèi)病變提供了一種很有前景的診斷方法。此外芙委，膀胱也是泌尿系統(tǒng)中的一個中空器官逞敷，負責儲存和控制尿液。膀胱熒光成像有助于精確監(jiān)測容量變化灌侣，這可能與包括貯積障礙在內(nèi)的下尿路癥狀有關推捐。圖6顯示了NIR-IIx熒光成像精確顯現(xiàn)了體內(nèi)的深層細節(jié)，具有推動臨床醫(yī)學成像的強大潛力侧啼。

(4) 通過 NIR-IIx 區(qū)域周圍的熒光寬視野顯微鏡進行大深度斷層掃描牛柒。用戶友好的熒光寬視場顯微鏡作為一種經(jīng)典技術，經(jīng)常用于細胞或組織切片成像痊乾。近年來皮壁，寬視場顯微鏡的成像窗口已轉(zhuǎn)移到NIR區(qū)域哪审。如今闪彼，NIR-II熒光寬視場顯微鏡已成功穿透~800μm的大腦深度。然而协饲，盡管成像深度很大，但焦平面誘導背景外的散射光子和信號光子將細節(jié)隱藏在“薄霧”之下缴川。憑借上述水的峰值吸收波長附近的熒光成像出色的SBR和空間分辨率茉稠，NIR-IIx區(qū)域周圍的寬視場顯微鏡被認為具有出色的性能，無需復雜的激發(fā)和采集模式把夸。從圖7a-p可知1425-1475nm的SBR是非常高的而线，但是考慮到強烈的光吸收引起有用信號的損失，故將1400-1550nm確認為用于深層成像時的波段恋日。

使用1400-1550nm對小鼠大腦血管成像膀篮，在約~1.3 mm處，仍然存在可識別的血管岂膳，這是迄今為止小鼠大腦中體內(nèi)NIR-II熒光顯微鏡z大的成像深度(超過 900 μm誓竿，潛在的白質(zhì)可能成為進一步可視化的障礙，圖像細節(jié)開始變得稀疏)谈截。

(5) 離峰NIR-II 熒光成像(即使用發(fā)射尾端而不是峰值區(qū)域)適合使用1400 nm長通 (NIR-IIx + NIR-IIb) 波段筷屡。利用IDSe-IC2F，其結構及合成示意見圖8a,b簸喂。它的吸收譜見圖8c，發(fā)射譜見圖8d喻鳄。在這里選用長波通熒光成像扼倘，IDSe-IC2F的長波通發(fā)射熒光光譜(900-1700nm,1000-1700nm,1100-1700nm,1200-1700nm,1300-1700nm,1400-1700nm,1500-1700nm)積分強度見圖8e。靜脈注射IDSe-IC2F NPs(1mg mL-1, 200 μL)后除呵，在793 nm連續(xù)激光激發(fā)下對小鼠進行全身成像再菊，相應圖像在900/1000/1100/ 1200/1300/1400/1500-1700nm如圖 8f-l 所示爪喘。經(jīng)過計算（見圖 8m），選定的三根血管在1400nm-LP圖像中顯示出z高的SBR袄简。此外腥放，進一步進行后肢成像，圖8n-t中水吸收峰附近的背景抑制很明顯绿语。所選的兩根血管的SBR 在1400-1700nm成像中達到z大值(圖8u)秃症。可以得出結論吕粹，NIR-IIx + NIR-IIb(1400-1700nm)成像的性能超過了NIR-IIb成像种柑。此外，900-nm-LP 熒光成像的質(zhì)量并不比1000nm-LP熒光成像的質(zhì)量差匹耕，這再次表明 900-1000nm不應被排除在NIR-II區(qū)域之外聚请。NIR-IIx + NIR-IIb熒光檢測將為離峰熒光成像甚至臨床成像引導手術帶來新的思路。

參考文獻：Feng, Z., Tang, T., Wu, T. et al. Perfecting and extending the near-infrared imaging window. Light Sci Appl 10, 197 (2021).

DOI：https://doi.org/10.1038/s41377-021-00628-0

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