多視圖共聚焦超分辨顯微鏡
技術(shù)出發(fā)點(diǎn)：
共聚焦顯微鏡憑借其對各種樣品成像時所具有的靈活性和可靠性樊破，目前仍然是生物醫(yī)學(xué)光學(xué)顯微鏡中的主力唆铐。 但是其存在點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)各向異性哲戚、分辨率衍射受限、散射樣品中與深度相關(guān)的退化(degradation)和體積漂白等問題艾岂。
文章創(chuàng)新點(diǎn)：
基于此顺少，美國國立衛(wèi)生研究院的Yicong Wu(一作兼通訊)等人提出一種多視圖(multiview)共聚焦顯微鏡王浴，在空間上從亞微米到毫米脆炎，在時間上從毫秒到小時級地增強(qiáng)共聚焦顯微鏡的性能氓辣。軸向和橫向分辨率提高兩倍以上的同時秒裕，還降低了光毒性钞啸。主要舉措有：
(1)几蜻、開發(fā)緊湊型線掃描儀喇潘，能夠在大面積上實(shí)現(xiàn)靈敏、快速梭稚、衍射極限的成像；
(2)弧烤、將線掃描與多視圖成像相結(jié)合忱屑，開發(fā)可提高分辨率各向同性并恢復(fù)因散射而丟失的信號的重建算法；
(3)暇昂、采用結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)莺戒，在密集標(biāo)記的厚樣品中實(shí)現(xiàn)超分辨率成像；
(4)话浇、結(jié)合深度學(xué)習(xí)，進(jìn)一步提高成像速度闹究、分辨率和持續(xù)時間。
作者對20多個不同的固定和活樣本進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)渣淤，包括單細(xì)胞中的蛋白質(zhì)分布；秀麗隱桿線蟲胚胎价认、幼蟲和成蟲的細(xì)胞核和發(fā)育中的神經(jīng)元嗅定；果蠅翅膀成蟲盤中的成肌細(xì)胞；以及小鼠腎臟用踩、食道渠退、心臟和腦組織等。
原理解析：
將多視圖成像脐彩，結(jié)構(gòu)光照明超分辨，基于深度學(xué)習(xí)的降噪惠奸、解卷積梅誓、圖像分割、超分辨預(yù)測相結(jié)合佛南，獲得具有高性能的多模成像顯微鏡梗掰。
(1)成像裝置。405nm嗅回、488nm及穗、561nm、647nm半導(dǎo)體激光器各自經(jīng)過半波片和二向色鏡后拥坛，合束進(jìn)入聲光可調(diào)諧濾光器(AOTF)蓬蝶。AOTF對入射光進(jìn)行開關(guān)和功率控制。隨后猜惋，AOTF的出光經(jīng)過兩個分光棱鏡分成三束光丸氛，由反射鏡和振鏡反射耦合進(jìn)標(biāo)號為A、B著摔、C三條寬帶單模光纖缓窜，振鏡用于調(diào)節(jié)耦合進(jìn)光纖的光功率。每一條寬帶單模光纖出光各自耦合進(jìn)一個共焦掃描模組谍咆，每個模組都包含一個MEMS線掃描儀、耦合光路摹察、物鏡恩掷、卷簾相機(jī)。A供嚎、B黄娘、C三個模組按順序輪流采集。每個模組實(shí)行線掃描克滴，卷簾相機(jī)的行掃描和線掃描照明對應(yīng)逼争，實(shí)現(xiàn)共焦劝赔。
(2)采用去噪、三視圖解卷積模型着帽，從低信噪比的各個視圖圖像獲得高信噪比的三視圖解卷積圖像杂伟，因?yàn)榻Y(jié)合了三個視圖的信息，相比單視圖圖像仍翰，其分辨率的各向同性能力得到提升稿壁。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用分割網(wǎng)絡(luò)區(qū)分細(xì)胞核歉备。低信噪比圖像的應(yīng)用傅是，意味著可以使用更弱的激發(fā)光和更快的采集速度蕾羊，因此成像速度和光毒性都能得到改善喧笔。
(3)多視圖結(jié)構(gòu)光照明超分辨。在三個正交方向上掃描線照明龟再，每個方向采集5張產(chǎn)生均勻相移的圖像书闸，平均處理后產(chǎn)生衍射極限圖像利凑。檢測每個照明z大值并重新分配其周圍的熒光信號(光子重新分配)浆劲，可提高線掃描方向上的空間分辨率嫌术。組合從多個視圖獲取的圖像體積進(jìn)一步提升體積分辨率。舉例說明度气，體積分辨率提升5.3倍：從335nmX285nmX575nm提升到225nmX165nmX280nm膨报。
(4)動態(tài)三維結(jié)構(gòu)光顯微成像磷籍。一維結(jié)構(gòu)光使得采集速度下降了15倍(因?yàn)槊總€方向采集5張圖，共三個方向)现柠，因此不適合實(shí)時超分辨應(yīng)用院领。在這里够吩，訓(xùn)練一個殘差信道注意力網(wǎng)絡(luò)(residual channel attention network, RCAN)從衍射極限輸入預(yù)測一維超分辨圖像比然。當(dāng)訓(xùn)練數(shù)據(jù)所用樣本的方向是隨機(jī)的時候，只需要旋轉(zhuǎn)輸入圖像周循，然后重新作為訓(xùn)練好的網(wǎng)絡(luò)輸入强法，再結(jié)合聯(lián)合解卷積鱼鼓，即可將一維超分辨拓展到二維超分辨拟烫。
附圖：
視頻：
表達(dá)Lifeact tdTomato的U2OS細(xì)胞三視圖二維SIM和原始視圖比較
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