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純相位空間光調(diào)制器在PSF工程中的應(yīng)用

發(fā)布時(shí)間:2022-05-31 19:42:04 瀏覽量:3844 作者:Max

摘要

本文簡(jiǎn)單介紹了點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)工程在熒光顯微鏡分辨中的應(yīng)用判没。使用空間光調(diào)制器(SLM)對(duì)熒光顯微鏡進(jìn)行校準(zhǔn),產(chǎn)生一個(gè)遠(yuǎn)低于衍射極限的波前誤差隅茎。從而提高成像系統(tǒng)的分辨率。

正文

純相位空間光調(diào)制在PSF工程中的應(yīng)用


一、引言


2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)揭曉昔逗,美國(guó)及德國(guó)三位科學(xué)家Eric Betzig出皇、Stefan W. Hell和William E. Moerner獲獎(jiǎng)。獲獎(jiǎng)理由是“研制出超分辨率熒光顯微鏡”,從此人們對(duì)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù) (PSF) 工程的認(rèn)識(shí)有了顯著提高魂毁。


Moerner 展示了 PSF 工程與 Meadowlark Optics SLM 的使用案例玻佩,用于熒光發(fā)射器的超分辨率成像和 3D 定位。 PSF工程已被證明使顯微鏡能夠使用多種成像模式對(duì)樣本進(jìn)行成像席楚,同時(shí)以非機(jī)械方式在模式之間變化夺蛇。這允許對(duì)具有弱折射率的結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像,以及對(duì)相位結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量測(cè)量酣胀。 已證明的成像方式包括:螺旋相位成像刁赦、暗場(chǎng)成像、相位對(duì)比成像闻镶、微分干涉對(duì)比成像和擴(kuò)展深成像甚脉。


美國(guó)Meadowlark Optics 公司專注于模擬尋址純相位空間光調(diào)制器的設(shè) 計(jì)、開(kāi)發(fā)和制造铆农,有40多年的歷史牺氨,該公司空間光調(diào)制器產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于自適應(yīng)光學(xué)散射或渾濁介質(zhì)中的成像墩剖,雙光子/三光子顯微成像猴凹,光遺傳學(xué),全息光鑷(HOT)岭皂,脈沖整形郊霎,光學(xué)加密,量子計(jì)算爷绘,光通信书劝,湍流模擬等領(lǐng)域。其高分辨率土至、高刷新率购对、高填充因子的特點(diǎn)適用于PSF工程應(yīng)用中。



圖1. Meadowlark 2022年新推出 1024 x 1024 1K刷新率SLM



二陶因、空間光調(diào)制器在PSF工程中的技術(shù)介紹


單分子定位顯微鏡(SMLM)中骡苞,通過(guò)從相機(jī)視場(chǎng)中稀疏分布的發(fā)射點(diǎn)來(lái)估計(jì)單個(gè)分子的位置,從而克服了分辨率的衍射限制楷扬〗庥模可實(shí)現(xiàn)的分辨率受到定位精度和熒光標(biāo)簽密度的限制,在實(shí)踐中可能是幾十納米的數(shù)量級(jí)毅否。有科研團(tuán)隊(duì)已經(jīng)將這種技術(shù)擴(kuò)展到三維定位亚铁。通過(guò)在光路中加入一個(gè)圓柱形透鏡或使用雙平面或多焦點(diǎn)成像,可以估算出分子的軸向位置螟加。光斑的拉長(zhǎng)(散光)或光斑大小的差異(雙平面成像)對(duì)軸向位置進(jìn)行編碼徘溢。將空間光調(diào)制器(SLM)與4F中繼系統(tǒng)結(jié)合到成像光路中吞琐,可以設(shè)計(jì)更廣泛的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF),為優(yōu)化顯微鏡的定位性能提供了可能然爆。


利用空間光調(diào)制器(SLM)對(duì)熒光顯微鏡進(jìn)行校準(zhǔn)站粟,可以建立一個(gè)遠(yuǎn)低于衍射極限波前誤差,SIEMONS團(tuán)隊(duì)就利用Meadowlark空間光調(diào)制器實(shí)現(xiàn)了高精度的波前控制曾雕。原理證明和實(shí)驗(yàn)顯示奴烙,在1微米的軸向范圍內(nèi),在x剖张、y和λ的精度低于10納米切诀,在z的精度低于20納米。對(duì)這篇文獻(xiàn)感興趣的話可以聯(lián)系我們查閱文獻(xiàn)原文《High precision wavefront control in point spread function engineering for single emitter localization 》


下面我們來(lái)具體看看是如何應(yīng)用的搔弄,以及應(yīng)用效果如何幅虑。


圖2. A)SLM校準(zhǔn)分支和通過(guò)光路的偏振傳輸示意圖。額外的線性偏振濾波沒(méi)有被畫(huà)出來(lái)顾犹,因?yàn)樗鼈兣c偏振分光器對(duì)齊倒庵。B)相機(jī)上的強(qiáng)度響應(yīng)作為λ/2-板不同方向α的SLM的相位延遲的函數(shù)。C) 光學(xué)裝置的示意圖炫刷。一個(gè)帶有SLM的中繼系統(tǒng)被添加到顯微鏡的發(fā)射路徑中(紅色)擎宝,一個(gè)單獨(dú)的SLM校準(zhǔn)路徑(綠色)被納入發(fā)射中繼系統(tǒng)中。這允許在實(shí)驗(yàn)之間進(jìn)行SLM校準(zhǔn)浑玛。BE:擴(kuò)束器绍申,DM:分色鏡,L:鏡頭锄奢,LPF:線性偏振濾鏡失晴,M:鏡子。OL:物鏡拘央,PBS:偏振分光鏡,TL:管鏡书在。


光路如上圖2所示灰伟,包括一臺(tái)尼康Ti-E顯微鏡,帶有TIRF APO物鏡(NA = 1.49儒旬,M = 100)栏账,一個(gè)200毫米的管狀鏡頭,一個(gè)帶有SLM的中繼系統(tǒng)被建立在顯微鏡的一個(gè)出口端口栈源。中繼系統(tǒng)包括兩個(gè)消色差透鏡挡爵,一個(gè)向列型液晶空間光調(diào)制器(LCOS)SLM(Meadowlark,XY系列甚垦,512x512像素茶鹃,像素大小=15微米涣雕,設(shè)計(jì)波長(zhǎng)=532納米)和一個(gè)偏振分光器,用于過(guò)濾未被SLM調(diào)制的X偏振光闭翩。第1個(gè)消色差透鏡在SLM上轉(zhuǎn)發(fā)光束挣郭。


第二個(gè)中繼鏡頭確保在emccd上對(duì)熒光物體進(jìn)行奈奎斯特采樣。顯微鏡配備了一套波長(zhǎng)為405nm疗韵、488nm兑障、561nm和642nm的合束激光器


這個(gè)配置增加了一個(gè)用于校準(zhǔn)SLM的第二個(gè)光路蕉汪。這個(gè)空降光調(diào)制器校準(zhǔn)光路是為測(cè)量入射到SLM上的X和Y偏振光之間的延遲差而設(shè)計(jì)的流译,為了測(cè)量某個(gè)SLM像素的調(diào)制,需要將SLM映射到校準(zhǔn)路徑的相機(jī)上者疤。這種映射是通過(guò)在SLM上施加一個(gè)電壓增加的棋盤(pán)圖案來(lái)獲得的先蒋。平均捕獲的圖像和沒(méi)有施加電壓時(shí)的圖像之間的差異被用作角落檢測(cè)算法(來(lái)自Matlab - Mathworks的findcheckerboard)的輸入,以找到角落點(diǎn)宛渐。對(duì)這些點(diǎn)進(jìn)行仿生變換竞漾,并用于找到對(duì)應(yīng)于每個(gè)SLM像素的cmos像素。


圖3. SLM校準(zhǔn)程序窥翩。A) 單個(gè)SLM像素的測(cè)量強(qiáng)度響應(yīng)作為應(yīng)用電壓的函數(shù)业岁。每一個(gè)極值都對(duì)應(yīng)于等于π的整數(shù)倍的相位變化,并擬合一個(gè)二階多項(xiàng)式以提高尋找極值的精度寇蚊。強(qiáng)度被分割成四個(gè)部分笔时,它們被縮放為[0 1]。這個(gè)歸一化的強(qiáng)度(B)被轉(zhuǎn)換為相位(C)仗岸,并反轉(zhuǎn)以創(chuàng)建該特定電壓段和像素的LUT(D)允耿。E)20個(gè)隨機(jī)選擇的SLM像素的歸一化強(qiáng)度響應(yīng),顯示像素間的變化扒怖。F) 測(cè)量的波前均方根誤差是校準(zhǔn)后立即使用校準(zhǔn)LUT的相位的函數(shù)较锡,45分鐘后,以及制造商提供的LUT盗痒。G) 在不同的恒定相位下蚂蕴,用于成像光路的SLM部分的LUTs。暗點(diǎn)表示沒(méi)有3個(gè)zui大值的像素俯邓。H) 測(cè)量的平均相位和預(yù)定相位之間的差異作為預(yù)定相位的函數(shù)骡楼。


圖3解釋了SLM像素的校準(zhǔn)程序。首先稽鞭,以256步測(cè)量作為應(yīng)用電壓函數(shù)的強(qiáng)度響應(yīng)鸟整,產(chǎn)生一連串的zui小值和zui大值,它們對(duì)應(yīng)于π或2π的遲滯朦蕴。在被照亮的SLM平面內(nèi)的所有像素似乎有三個(gè)zui大值篮条,這意味著總的相位調(diào)制為4π或1094納米弟头。這些極值出現(xiàn)的電壓是通過(guò)對(duì)極值附近的三個(gè)點(diǎn)進(jìn)行擬合拋物線來(lái)找到的,這增加了精度兑燥,并充分利用了SLM的16位控制亮瓷。然后,強(qiáng)度被分為四段降瞳,用公式(11)的逆值對(duì)這些段進(jìn)行縮放并轉(zhuǎn)換為相位嘱支。相位響應(yīng)被用來(lái)為每個(gè)SLM像素構(gòu)建一個(gè)單獨(dú)的查找表(LUT),以補(bǔ)償SLM的非均勻性挣饥。LUT參數(shù)在SLM上平滑變化除师,并與肉眼可見(jiàn)的法布里-珀羅條紋大致對(duì)應(yīng),表明相位響應(yīng)的差異是由于液晶層厚度的變化造成的扔枫。額外的像素與像素之間的變化可能來(lái)自底層硅開(kāi)關(guān)電路的像素與像素之間的變化汛聚。完整的校準(zhǔn)需要大約5分鐘(在四核3.3GHz i7處理器上的3分鐘掃描和2分鐘計(jì)算時(shí)間),但原則上可以優(yōu)化到運(yùn)行更快短荐。


實(shí)驗(yàn)結(jié)果:

圖4 測(cè)量的PSF與矢量PSF模型擬合之間的PSF比較倚舀。G-I)平均測(cè)量的PSF是由大約108個(gè)光子攜帶的信號(hào)通過(guò)上采樣(3×)和覆蓋所有獲得的斑點(diǎn)編制而成。比例尺表示1μm忍宋。


圖4顯示PSF模型的預(yù)測(cè)結(jié)果痕貌。通過(guò)這種方式,實(shí)驗(yàn)的PSF是由~108個(gè)光子的累積信號(hào)建立起來(lái)的糠排。實(shí)驗(yàn)和理論上的矢量PSF之間的一致性通常是非常好的舵稠,甚至在離焦值的邊緣結(jié)構(gòu)也是非常匹配的。剩下的差異入宦,主要是光斑的輕微變寬哺徊,是由于入射到相機(jī)上的光的非零光譜寬度,由于發(fā)射光譜的寬度和四帶分色器的帶通區(qū)域的寬度乾闰。邊緣結(jié)構(gòu)中也有一個(gè)小的不對(duì)稱性落追,這可能是由光學(xué)系統(tǒng)中殘留的高階球差造成的。


所有工程PSF的一個(gè)共同特點(diǎn)是汹忠,與簡(jiǎn)單的二維聚焦斑點(diǎn)相比淋硝,它們的復(fù)雜性必須在PSF模型中得到體現(xiàn),該模型被用于估計(jì)三維位置(可能還有發(fā)射顏色或分子方向)的參數(shù)擬合算法宽菜。簡(jiǎn)化的PSF模型,如高斯模型竿报、基于標(biāo)量衍射的Airy模型铅乡、Gibson-Lanni模型,或基于Hermite函數(shù)的有效模型都不能滿足這一要求烈菌。一個(gè)解決方案是使用實(shí)驗(yàn)參考PSF阵幸,或用花樣擬合這樣的PSF作為模型PSF花履,或者使用一個(gè)或多個(gè)查找表(LUTs)來(lái)估計(jì)Z-位置。矢量PSF模型也可以用于復(fù)雜的3D和3D+λ工程PSF挚赊。眾所周知诡壁,矢量PSF模型是高NA熒光成像系統(tǒng)中圖像形成的物理正確模型。復(fù)雜的工程PSF的另一個(gè)共同特點(diǎn)是對(duì)擾亂設(shè)計(jì)的PSF形狀的像差的敏感性荠割,并以這種方式對(duì)精度和準(zhǔn)確性產(chǎn)生負(fù)面影響妹卿。為了實(shí)現(xiàn)精確到Cramér-Rao下限(CRLB),即無(wú)偏估計(jì)器的精度蔑鹦,光學(xué)系統(tǒng)的像差水平應(yīng)該被控制在衍射極限(0.072λ均方根波前像差)夺克,這個(gè)條件在實(shí)踐中往往無(wú)法滿足。因此嚎朽,需要使用可變形鏡或?yàn)楫a(chǎn)生工程PSF而存在的SLM對(duì)像差進(jìn)行校正铺纽。自適應(yīng)光學(xué)元件的控制參數(shù)可以使用基于圖像的指標(biāo)或通過(guò)測(cè)量待校正的像差來(lái)設(shè)置。后者可以通過(guò)基于引入相位多樣性的相位檢索算法來(lái)完成哟忍,通常采用通焦珠掃描的形式狡门。這已經(jīng)在高數(shù)值孔徑顯微鏡系統(tǒng)、定位顯微鏡中實(shí)現(xiàn)锅很,并用于提高STED激光聚焦的質(zhì)量其馏。


三、PSF應(yīng)用對(duì)液晶空間光調(diào)制器的要求


1.光利用率


對(duì)于這個(gè)應(yīng)用來(lái)說(shuō)粗蔚,SLM將光學(xué)損失降到非常低是很重要的尝偎。PSF工程使用SLM來(lái)操縱顯微鏡發(fā)射路徑上的波前。在不增加損失的情況下鹏控,熒光成像中缺乏信號(hào)致扯。使用具有高填充系數(shù)的SLM可以大限度地減少衍射的損失。


Meadowlark公司能提供標(biāo)速版95.6%的空間光調(diào)制器当辐,分辨率達(dá)1920x1200抖僵,高刷新率版像素1024x1024,填充因子97.2%和dielectric mirror coated版本(100%填充率)缘揪。鍍介電膜版本的SLM反射率可以做到100%耍群,一級(jí)衍射效率可以做到98%。高分辨率能在滿足創(chuàng)建復(fù)雜相位函數(shù)的同時(shí)找筝,能夠提升系統(tǒng)的光利用率蹈垢。


2.刷新率(可達(dá)1K Hz)


高速度可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)的深層組織超分辨率成像。可見(jiàn)光波段可達(dá)1K Hz刷新速度(@532nm)袖裕。


3.分辨率(1920x1200)


高分辨率的SLM是創(chuàng)建三維定位所需的復(fù)雜相位函數(shù)的理想選擇曹抬,如此能夠?qū)γ總€(gè)小像元區(qū)域的光場(chǎng)進(jìn)行自由調(diào)控。



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