熒光顯微鏡是一種核心的生物醫(yī)學成像工具，可提供活體樣本分子對比的高分辨率圖像摇予。生物系統(tǒng)中含有豐富的內(nèi)源性熒光團汽绢，這些熒光團以一種方便、無標記的方式用于自熒光分子成像侧戴。
熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)利用熒光的壽命特性，因其對分子環(huán)境和分子構象變化的高度敏感性而得到廣泛應用。FLIM已廣泛應用于研究細胞代謝的自熒光分子成像塑猖。自熒光分子的FLIM以非破壞性的方式提供了對細胞健康的獨特見解，經(jīng)常用于研究活體動物疆拘。
FLIM有利于探測熒光團的分子環(huán)境，以了解光強測量無法闡明的熒光團行為寂曹。圖1中概述了時域和頻域的FLIM測量哎迄，并在下面進行詳細描述。簡單地說隆圆，時域熒光壽命測量使用短脈沖光進行激發(fā)(相對于樣品的壽命較短)漱挚，然后直接(即通過門控檢測或脈沖采樣)或使用時間分辨電子技術記錄熒光分子的指數(shù)衰減如圖1(a)及1(b)。另外匾灶，頻域技術也可以測量熒光壽命如圖1(c)和1(d)棱烂。這里租漂，激勵是連續(xù)的阶女，隨著時間的推移，振幅調(diào)制為正弦波哩治。熒光信號的相位和振幅隨激發(fā)波的變化而變化秃踩。通過繪制在一定調(diào)制頻率范圍內(nèi)的相位變化，可以看到熒光團的相位延遲和振幅調(diào)制如圖1(d)业筏。得到的熒光正弦信號可以在頻域解調(diào)憔杨，以量化熒光強度指數(shù)衰減引起的延遲。
圖1
FLIM常見的實現(xiàn)是使用一種稱為TCSPC的快速電子方法如圖1(a)蒜胖。在TCSPC中消别，一個快速秒表測量一個激發(fā)光子和發(fā)射光子。這個時間定義了每個發(fā)射光子的到達時間台谢。用時間-幅值轉換電路(TAC)對快時鐘時間進行實驗測量寻狂，該電路將光子到達時間轉換為可記錄的模擬電壓。在傳統(tǒng)的TCSPC中朋沮，在高光子計數(shù)率下蛇券，由于儀器的死區(qū)時間，大多數(shù)入射光子將無法被測量樊拓。這將導致堆積效應纠亚，即每個激發(fā)脈沖只記錄到達時間較短的光子。光子的損失與較長的到達時間將產(chǎn)生一個不正確的光子直方圖筋夏，導致測量的熒光壽命的整體縮短蒂胞。為了避免這些影響，探測器上的光子計數(shù)較低是可取的条篷，理想情況下<10%的激勵重復率骗随。因此岳瞭，通常情況下，時域方法通過多個激勵脈沖檢測一個熒光光子蚊锹，因此需要多個激勵脈沖來構建直方圖如圖1(a)及1(b)瞳筏。通過光子計數(shù)測量的FLIM的信噪比，(SNR)取決于每個像素(N)檢測到的光子數(shù)量牡昆，因此它隨N的平方根而變化姚炕。
因此，為了改進FLIM的信噪比丢烘，光子探測過程重復數(shù)千次柱宦，生成熒光光子到達時間的分布，即測量到的指數(shù)熒光衰減播瞳，提高了通過曲線擬合的FLIM數(shù)據(jù)分析的準確性掸刊。
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