雖然振動(dòng)光譜是具有化學(xué)特異性的光學(xué)對(duì)比的理想候選者，并提供了熒光標(biāo)記和染料染色的無(wú)標(biāo)記替代方案证鸥，基于紅外吸收和自發(fā)拉曼散射的顯微鏡分別受到低空間分辨率和本質(zhì)微弱信號(hào)的限制僚楞。相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)可以通過(guò)提供弱自發(fā)拉曼散射信號(hào)的相干信號(hào)放大數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)來(lái)克服這些限制勤晚。而SRS可以進(jìn)一步的避免CARS的局限性。
SRS相對(duì)于自發(fā)拉曼與CARS的優(yōu)點(diǎn)
SRS是另一種相干拉曼散射(CRS)過(guò)程镜硕，其激發(fā)條件與共振CARS相同运翼。與自發(fā)拉曼散射不同，在自發(fā)拉曼散射中兴枯，樣品被一個(gè)激發(fā)場(chǎng)照亮，SRS中兩個(gè)激發(fā)場(chǎng)在泵浦頻率ωp和斯托克斯頻率ωs處重合在樣品上矩欠。如果激發(fā)束的差頻Δω = ωp?ωs與焦點(diǎn)內(nèi)分子的振動(dòng)頻率Ω相匹配财剖，即分子躍遷由于分子躍遷的刺激激發(fā)，速率提高癌淮。分子居群從基態(tài)通過(guò)虛態(tài)轉(zhuǎn)移到分子的振動(dòng)激發(fā)態(tài)(圖1A)躺坟。這與自發(fā)拉曼散射相反，自發(fā)拉曼散射從虛態(tài)到振動(dòng)激發(fā)態(tài)的轉(zhuǎn)變是自發(fā)的乳蓄，導(dǎo)致信號(hào)弱得多咪橙。
圖1.受激拉曼散射原理(A) SRS的能量圖。泵浦和斯托克斯束的共同作用通過(guò)虛態(tài)有效地將樣品中的分子從基態(tài)轉(zhuǎn)移到第一振動(dòng)激發(fā)態(tài)虚倒。被激發(fā)的振動(dòng)狀態(tài)可以通過(guò)調(diào)節(jié)泵和斯托克斯梁之間的頻率差來(lái)選擇美侦。(B) SRS作為能量轉(zhuǎn)移過(guò)程。由于分子振動(dòng)的激勵(lì)魂奥，一個(gè)泵浦光子被吸收菠剩，一個(gè)斯托克斯光子被產(chǎn)生，這分別導(dǎo)致了傳輸泵浦光束和斯托克斯光束的SRL和SRG耻煤。
由于分子振動(dòng)的相干激發(fā)(圖1B)具壮，一個(gè)泵浦光子被樣品吸收，產(chǎn)生一個(gè)斯托克斯光子哈蝇。這導(dǎo)致傳輸泵浦和斯托克斯光束強(qiáng)度的損耗(受激拉曼損耗棺妓，SRL)和增益(受激拉曼增益，SRG)分別為ΔIp和ΔIS:
其中N為探針體積中的分子數(shù)σ拉曼為分子拉曼散射截面炮赦。
在SRS顯微鏡中怜跑，我們測(cè)量ΔIp (SRL)或ΔIS (SRG)作為樣品位置的函數(shù)。因?yàn)棣∝N眼五，即信號(hào)與目標(biāo)物種的濃度c成正比妆艘，現(xiàn)在有可能生成樣品的定量化學(xué)圖。不同的化學(xué)物質(zhì)可以根據(jù)不同的振動(dòng)頻率被靶向看幼，如自發(fā)拉曼文獻(xiàn)中記錄的ΔI∝σ拉曼批旺。
由于信號(hào)對(duì)激發(fā)強(qiáng)度的非線性依賴性，SRS允許與雙光子顯微鏡類似的本征光學(xué)切片诵姜，消除了共聚焦針孔的需要汽煮。這對(duì)于厚組織樣本的成像尤其有用。
表1.自發(fā)拉曼散射與相干拉曼散射的比較
| 自發(fā)拉曼散射 | SRS |
| 單光子過(guò)程 | 多光子過(guò)程 |
| 極慢成像(>20分鐘/幀) | 快速成像，可達(dá)(30 fps) |
| 無(wú)固有z分辨率 | 光學(xué)切片 |
| 可見光/紫外光束激發(fā)增強(qiáng)散射 | 激發(fā)與近紅外光束增強(qiáng)成像深度 |
| 易受背景熒光影響 | 對(duì)背景熒光免疫 |
| 全光譜 | 選定的光譜信息 |
表2. CARS和SRS的比較
| CARS | SRS |
| 參數(shù)化過(guò)程 | 能量傳遞過(guò)程 |
| 新光頻信號(hào) | 透射激勵(lì)光束的強(qiáng)度增益和損耗 |
| 非特定的非共振背景 | 無(wú)非共振背景 |
| 扭曲的光譜 | 與自發(fā)拉曼光譜相同 |
| 相干圖像偽影 | 信號(hào)是物體與點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的卷積 |
| 非線性濃度依賴性 | 線性濃度依賴性 |
CARS的產(chǎn)生條件與SRS相同暇赤，但檢測(cè)方法不同心例。在SRS中，可以檢測(cè)到激勵(lì)束的強(qiáng)度增益和強(qiáng)度損失鞋囊，而在CARS止后，反斯托克斯頻率下的新輻射ωaS = 2ωp?ωS 。CARS是由被稱為四波混合的光學(xué)參量過(guò)程產(chǎn)生的溜腐，在這個(gè)過(guò)程中能量在光場(chǎng)之間交換译株。這與SRS相反，SRS是光場(chǎng)和樣品之間的能量傳遞過(guò)程挺益。這解釋了為什么如果Δω不匹配樣品的振動(dòng)頻率歉糜，因此不受非共振背景的影響，SRS不能發(fā)生望众，因?yàn)闃悠窙](méi)有吸收量子振動(dòng)能量的本征態(tài)匪补。
盡管與自發(fā)拉曼散射顯微鏡相比，CARS在成像速度上有很大的優(yōu)勢(shì)烂翰，但在生物醫(yī)學(xué)研究中尚未被廣泛接受夯缺。與其他顯微鏡技術(shù)相比，CARS由于樣品的電子響應(yīng)和相干信號(hào)相加引起的非共振背景信號(hào)的困難而不能直接解釋圖像刽酱。CARS顯微鏡的特定限制是：空間干擾造成的圖像失真?光譜干擾造成的光譜失真?信號(hào)對(duì)目標(biāo)物種濃度的非線性依賴?靈敏度有限(弱共振信號(hào)被埋在與非共振背景相關(guān)的激光噪聲中喳逛。
綜上所述，與自發(fā)拉曼散射相比棵里，SRS具有相干拉曼散射技術(shù)的所有優(yōu)點(diǎn)(見表1)润文，但克服了CARS顯微鏡的局限性(見表2)。
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