移動(dòng)一個(gè)緊密聚焦的激光光斑在樣品上，逐點(diǎn)記錄信號(hào)摘昌，以便在計(jì)算機(jī)重建速妖。由于相干拉曼散射技術(shù)在入射光強(qiáng)方面是非線性的，將所有的激光能量壓縮成一個(gè)光斑聪黎，并在樣品上方高速移動(dòng)該光斑罕容，將使CARS或SRS信號(hào)在給定的總平均功率下被應(yīng)用到樣品上。此外稿饰，掃描可以很容易地利用相干拉曼散射固有的光學(xué)切片能力锦秒，因?yàn)樾盘?hào)只在聚焦尤為緊密的部分產(chǎn)生。
相干拉曼技術(shù)中常用的掃描方案
掃描有兩種常用的方法:樣品掃描和光束掃描喉镰。樣品掃描提供了一個(gè)簡(jiǎn)單的設(shè)備旅择，但通常較低的速度和較小的視野，而光束掃描更復(fù)雜的實(shí)現(xiàn)侣姆，對(duì)光學(xué)系統(tǒng)的性能要求更高生真，但提供了更大的視野和更高的成像速度脖咐。
在樣品掃描中，整個(gè)相干拉曼光學(xué)設(shè)置是固定的汇歹，樣品相對(duì)于焦點(diǎn)平移屁擅。這意味著光學(xué)系統(tǒng)可以對(duì)準(zhǔn)一個(gè)固定的激光束，這比在一系列可能的激光束位置上對(duì)準(zhǔn)系統(tǒng)更容易产弹。為了獲得高的空間分辨率派歌，需要一個(gè)平移階段具有較高的精度和重復(fù)性要求。通常痰哨，采用壓電驅(qū)動(dòng)的彎曲級(jí)胶果。這些階段提供的步長(zhǎng)和重復(fù)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過光學(xué)顯微鏡(通常小于5 nm)和較大數(shù)百微米的平移所要求的。這種制度主要有兩個(gè)缺點(diǎn):一是圖像的較大視場(chǎng)是由舞臺(tái)的較大行程決定的斤斧，而不是光學(xué)早抠。因此，切換到倍率較低的鏡頭并不能提供大的視野撬讽。通常情況下蕊连，使用10倍倍率物鏡的光學(xué)顯微鏡可以獲得>1毫米的視野，但使用壓電臺(tái)則無法獲得這些視野游昼。二是這些級(jí)的機(jī)械共振頻率通常將較大掃描速度限制在每行至少數(shù)十毫秒(或更高)甘苍，這意味著它們至少比波束掃描系統(tǒng)慢一個(gè)數(shù)量級(jí)。
盡管有這些限制烘豌，樣本掃描的簡(jiǎn)單性使它在許多情況下成為一個(gè)可行的選擇载庭。樣品掃描系統(tǒng)的光學(xué)吞吐量也非常高，因?yàn)樾枰墓鈱W(xué)是物鏡廊佩。當(dāng)發(fā)射束被進(jìn)一步分析時(shí)囚聚，樣品掃描也會(huì)有好處，例如标锄，通過光譜儀顽铸，在光譜儀中，光束的移動(dòng)會(huì)造成偽影鸯绿。
另外也可以通過掃描樣品上的組合激光焦點(diǎn)并記錄CARS或SRS信號(hào)作為位置的函數(shù)來形成圖像跋破。激光掃描是通過一對(duì)通過線圈的電流產(chǎn)生角度偏轉(zhuǎn)的振鏡來完成的。普通非諧振振鏡的掃描線率高達(dá)~ 1khz瓶蝴，而諧振振鏡的掃描線率高達(dá)~ 8khz毒返。行率除以每個(gè)圖像的行數(shù)(通常為512)決定了成像系統(tǒng)的幀率。行周期(行速率的倒數(shù))除以每行像素?cái)?shù)(通常是512)決定了掃描系統(tǒng)中的像素停留時(shí)間舷手。對(duì)于一個(gè)普通的非諧振振鏡拧簸，成像速度為每秒2幀，像素停留時(shí)間為2 μs是可能的男窟。
圖1.激光掃描顯微鏡的光路示意圖盆赤。給出了奧林巴斯系統(tǒng)的近似焦距(FL)贾富。通過顯微鏡的光束路徑顯示了鏡鏡的兩個(gè)位置。黑色鏡面對(duì)應(yīng)著穿過光學(xué)系統(tǒng)中心的紅色通道牺六〔梗灰色鏡面對(duì)應(yīng)著穿過光學(xué)系統(tǒng)邊緣的橙色路徑。掃描透鏡/管透鏡系統(tǒng)有雙重用途:放大輸入激光束以匹配物鏡后孔徑淑际，并將掃描鏡位置成像到后孔徑上畏纲，以避免光束夾擊。盡管這張圖只顯示了一維掃描春缕，但可以使用靠近第①個(gè)掃描鏡的第②個(gè)掃描鏡來掃描正交軸盗胀，或者可以在這里所示的配置中使用一個(gè)兩軸掃描鏡。雖然這里顯示的是簡(jiǎn)單的單線態(tài)透鏡锄贼，但一個(gè)真正的掃描光學(xué)系統(tǒng)是由多元件透鏡組成的票灰，以獲得色差校正和一個(gè)平坦的掃描場(chǎng)。
掃描系統(tǒng)由掃描鏡宅荤、一對(duì)中繼透鏡和物鏡組成屑迂。中繼透鏡，被稱為掃描透鏡和管透鏡(按光束傳播順序)膘侮，其目的是在顯微鏡物鏡的后孔徑上產(chǎn)生掃描鏡的放大圖像屈糊。這是必要的，因?yàn)樵诮蛊矫嫔?mark class="span_mark" data-type="1">對(duì)焦斑的掃描是通過掃描激光束在后孔徑上的入射角度來完成的琼了，激光光斑在該位置的運(yùn)動(dòng)是較小的。由于光束夾持(稱為“暈光”)夫晌，在物鏡背面孔徑上激光光斑的運(yùn)動(dòng)將產(chǎn)生不均勻的照明強(qiáng)度雕薪。此外，利用這兩個(gè)透鏡組合的放大倍率來增加入射光束的直徑晓淀，該直徑必須小于4毫米所袁，但應(yīng)該足夠大，以填補(bǔ)物鏡后孔徑(~ 5-10毫米)凶掰，以實(shí)現(xiàn)緊密聚焦燥爷。圖1為兩種不同掃描鏡位置的激光掃描顯微鏡內(nèi)部光路，用不同顏色表示懦窘。管透鏡和掃描透鏡系統(tǒng)的成像作用是明確的前翎，因?yàn)閮蓚€(gè)掃描鏡角度的光束都擊中相同的位置，和放大作用表現(xiàn)為光束尺寸的變化畅涂。掃描通常在計(jì)算機(jī)控制下完成港华，掃描控制器計(jì)算機(jī)還記錄像素強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，以便在屏幕上繪制圖像午衰。
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