暗場(chǎng)成像的應(yīng)用

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暗場(chǎng)成像的應(yīng)用

暗場(chǎng)顯微鏡是一種很好的成像技術(shù)箕肃，因?yàn)樗试S研究人員觀察樣品中的細(xì)節(jié)和結(jié)構(gòu)，而這些細(xì)節(jié)和結(jié)構(gòu)可能很難用其他類型的顯微鏡（例如明場(chǎng)或熒光顯微鏡）看到今魔。

暗場(chǎng)顯微鏡的一些具體優(yōu)點(diǎn)包括：

1勺像、高對(duì)比度：通過從側(cè)面或背面照亮樣品，暗場(chǎng)顯微鏡可以在黑暗背景下創(chuàng)建樣品的明亮圖像错森，從而更容易看到使用其他技術(shù)可能難以看到的細(xì)節(jié)和結(jié)構(gòu)吟宦。

2、提高分辨率：暗場(chǎng)顯微鏡產(chǎn)生的高對(duì)比度圖像有助于提高圖像的分辨率涩维，使研究人員能夠看到樣品中更小的細(xì)節(jié)和結(jié)構(gòu)殃姓。

3、適用于透明樣品：暗場(chǎng)顯微鏡對(duì)于研究透明樣品特別有用，例如活細(xì)胞或小生物體蜗侈，這些樣品很難用其他技術(shù)看到篷牌。

4、可用于多種樣品：暗場(chǎng)顯微鏡可用于范圍廣泛的樣品踏幻，包括生物枷颊、礦物和材料科學(xué)樣品。

總的來(lái)說该面，暗場(chǎng)顯微鏡對(duì)于希望研究透明夭苗、低對(duì)比度或難以用其他技術(shù)觀察的樣品的研究人員來(lái)說是一種有價(jià)值的工具吆倦。它可以提供高對(duì)比度听诸、高分辨率的圖像，幫助研究人員更好地了解樣本的結(jié)構(gòu)和特性蚕泽。

暗場(chǎng)顯微觀察是一種利用傾斜照明改善常規(guī)照明條件下成像質(zhì)量不佳標(biāo)本對(duì)比度的技術(shù)。直射光被聚光鏡內(nèi)的不透明光闌阻擋后桥嗤，從傾斜角度穿過樣品的光線經(jīng)過衍射须妻、折射并反射到顯微鏡物鏡內(nèi)，形成疊加在深色背景上的明亮樣品圖像泛领。這種深色背景能夠提供較高的對(duì)比度荒吏，并且輕松讓背景效果不佳的標(biāo)本更加突出。下面是一些圖片示例渊鞋。

暗場(chǎng)顯微鏡x1000所見紅細(xì)胞

暗場(chǎng)顯微鏡圖像——顯微水螨幼蟲的暗場(chǎng)圖像

暗場(chǎng)顯微鏡圖像——有絲分裂蔥根尖

暗場(chǎng)照明需要阻擋通常穿過樣品和環(huán)繞樣品周圍的大部分光線绰更，僅允許傾斜光線照射在樣品上。暗場(chǎng)聚光鏡的頂部透鏡為球形凹面锡宋，其允許從頂部透鏡表面發(fā)射的光線形成一個(gè)倒置空心圓錐體，并將焦點(diǎn)集中在樣品平面上执俩。在沒有樣品且聚光鏡數(shù)值孔徑大于物鏡的地方徐钠，傾斜光線會(huì)相互交叉并錯(cuò)開物鏡，從而讓這些區(qū)域變暗役首。將標(biāo)本（尤其是未染色且不吸收光線的標(biāo)本）放在載玻片上時(shí)尝丐，傾斜光線會(huì)與標(biāo)本發(fā)生相互作用，并被諸如細(xì)胞膜衡奥、細(xì)胞核和內(nèi)部細(xì)胞器等標(biāo)本內(nèi)部的要素所衍射爹袁、反射和/或折射。這些微弱的光線就會(huì)進(jìn)入物鏡矮固。zui終效果就是在黑色背景上呈現(xiàn)出明亮的標(biāo)本圖像失息。

通常情況下，在適于暗場(chǎng)照明成像的觀察對(duì)象看上去非常絢麗。在明場(chǎng)顯微觀察中本身對(duì)比度非常低的標(biāo)本往往在暗場(chǎng)觀察時(shí)非常耀眼奪目根时。暗場(chǎng)照明特別適合顯示輪廓瘦赫、邊緣、邊界和折射率梯度蛤迎。暗場(chǎng)照明的理想候選對(duì)象包括微小的水生生物确虱、硅藻、小昆蟲替裆、骨校辩、纖維、頭發(fā)辆童、未染色的細(xì)菌宜咒、酵母、組織培養(yǎng)細(xì)胞和原生動(dòng)物把鉴。適合暗場(chǎng)觀察的非生物標(biāo)本則包括礦物和化學(xué)晶體故黑、膠體顆粒、粉塵計(jì)數(shù)標(biāo)本庭砍、以及包含細(xì)小夾雜物场晶、孔隙率差異或折射率梯度的聚合物和陶瓷薄片。

使用暗場(chǎng)顯微觀察存在哪些挑戰(zhàn)怠缸？

在制備用于暗場(chǎng)顯微觀察的標(biāo)本時(shí)必須特別當(dāng)心诗轻，原因是位于焦平面上方和下方的特征會(huì)散射光線并導(dǎo)致圖像質(zhì)量下降揭北。載玻片的清潔度是影響成像的重要因素扳炬，在暗場(chǎng)照明中，由于細(xì)微碎屑均會(huì)被照亮搔体，并且讓你無(wú)法看清想要觀察的部分恨樟，因此其重要性更甚。

暗場(chǎng)顯微鏡與高光譜成像相結(jié)合嫉柴，為研究組織厌杜、活細(xì)胞或溶液中的納米材料提供了一種有效的方法。來(lái)自等離子體或其他納米結(jié)構(gòu)的散射光提供了有關(guān)其組成计螺，大小和分布的有用信息夯尽。

Photon等為高光譜暗場(chǎng)成像提供了兩種不同的平臺(tái)：可調(diào)諧激光源（TLS）允許在激發(fā)中濾波和IMA，一個(gè)提供發(fā)射濾波的平臺(tái)登馒。

TLS由兩個(gè)模塊組成：超連續(xù)源（寬帶源）和基于光子等體積布拉格光柵（VBG）技術(shù)的激光線可調(diào)諧濾波器（LLTF-帶通濾波器）匙握。IMA由高光譜成像濾光片超立方體組成，也基于VBG陈轿。當(dāng)與配備暗場(chǎng)聚光鏡的研究級(jí)顯微鏡結(jié)合使用時(shí)圈纺，TLS和超立方體可以將該顯微鏡轉(zhuǎn)換為高光譜暗場(chǎng)設(shè)置。這些系統(tǒng)在可見光（400-1000nm）蛾娶、NIR（900-1620）nm或兩者（400-1620nm）光譜范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)諧灯谣。這種zui先jin的平臺(tái)允許對(duì)納米材料進(jìn)行深入表征，而無(wú)需任何特殊的樣品制備蛔琅。

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相關(guān)文獻(xiàn)：

[1] Patskovsky, S., Bergeron, E., & Meunier, M. (2013). Hyperspectral darkfield microscopy of PEGylated gold nanoparticles targeting CD44-expressing cancer cells. Journal of Biophotonics, 8(1–2), 162–167.

[2] https://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/dfield.html

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