發(fā)生Bleedthrough和crosstalk的原因是在熒光顯微鏡中經常被混淆的兩個問題，當然這兩種現象本身也不宜分清折砸，本文對這兩者進行解釋航揉，方便對癥下藥解決問題。
Bleedthrough還是Crosstalk，這是一個問題
以下三張放大40倍圖片是FITC標記的肌動蛋白和Cy3標記線粒體去枷，并使用Lumencor SPECTRA X八通道LED顯微鏡光源對兩種熒光染料進行激發(fā)怖辆，用于顯示Bleedthrough和crosstalk的不同表現以及不同的解決方案。
圖1.SPECTRA X 光引擎
青色光通道激發(fā)竖螃，485/25濾光片，Semrock LED-DA/FI/ TR/Cy5-4X 四帶通多邊分束器和發(fā)射濾光片
在這幅圖像中同時存在bleedthrough和crosstalk現象逗余。Bleedthrough表現為圖像中細胞外灰度相對較高(對比圖2特咆，已消除bleedthrough的情況)。
圖2.SPECTRA X 光引擎
青色光通道激發(fā)录粱，475/28濾光片坚弱，Semrock LED-DA/FI/ TR/Cy5-4X 四帶通多邊分束器和發(fā)射濾光片
通過改變激發(fā)濾光片的通帶蜀备，使其不與多邊發(fā)射濾光片的通帶相交，從而消除了bleedthrough荒叶。Bleedthrough的原因是激發(fā)光通過發(fā)射濾光片傳輸到相機碾阁。通過檢測細胞核周圍的線粒體熒光，本圖像中仍然存在crosstalk(與圖3相比些楣，圖3消除了crosstalk脂凶，產生肌動蛋白的特異性圖像)。
圖3.SPECTRA X 光引擎
青色光通道激發(fā)愁茁，475/28濾光片蚕钦，Semrock 單帶通FITC二向色鏡和發(fā)射濾光片
從根本上說，crosstalk是由于熒光團(如FITC和Cy3)的激發(fā)和發(fā)射光譜的波長范圍有所交集鹅很。即使Cy3熒光團是較合適被綠色(~550 nm)光激發(fā)嘶居，它同樣也能被青色(475 nm)光激發(fā)到足夠的程度，在圖2中很容易被檢測到促煮。通過將四帶通多邊分束器和發(fā)射濾光片改為單帶通二向色鏡和發(fā)射濾光片來消除crosstalk信號邮屁，從而在檢測系統(tǒng)的發(fā)射側實現了更精確的阻擋。這種解決方案是一種妥協(xié)菠齿，因為它以速度為代價提高了分辨率佑吝。
當然在熒光成像時，我們需要盡可能的去減小bleedthrough以及crosstalk的影響
選擇熒光染料時绳匀，應盡量選擇發(fā)射光譜帶寬較窄的
同時使用多種熒光染料時芋忿，應盡量選擇光譜間沒有重疊的，以免產生信號串擾疾棵，或者也可適當降低某幾種熒光染料的濃度戈钢。如下圖中DyLight 405，FITC以及Texas Red三種熒光染料是尔，發(fā)生光譜間幾乎沒有重疊逆趣，以他們進行三種顏色標記時發(fā)生的串色效應就會很小。
熒光團激發(fā)和發(fā)射光譜必須與系統(tǒng)的光源和濾光片組特性相匹配
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