用于亞納米聚焦和單分子成像的激光直寫

正文

用于亞納米聚焦和單分子成像的激光直寫

技術(shù)背景：

單分子顯微鏡極大地擴展了我們對細胞環(huán)境中蛋白質(zhì)復合物的結(jié)構(gòu)組織真椿、功能構(gòu)象(functional conformations)和動力學的了解鹃答。近來的研究在提高其空間分辨率 、穿透深度突硝、活細胞成像能力和單分子成像方法上取得了顯著進展。

具有高空間分辨率的單分子成像方法都采用軸向聚焦鎖定(如全內(nèi)反射模式的紅外激光)和橫向校正方法(如熒光標記)的組合狞换。以高準確度(~1nm)執(zhí)行的實時三維聚焦鎖定將來自單個熒光事件的光子收集z大化避咆，并且與沒有主動穩(wěn)定的標準方法相比舟肉，定位精度提高了>10 倍。不準確或緩慢的主動校正會導致漂移查库，降低定位精度并顯著降低原位分辨率(即使在過濾或分組等分析后處理之后也是如此)。

通過結(jié)合光學捕獲和優(yōu)化單個發(fā)射器的x/y位置和寬度 (z)樊销，已將具有納米精度的實時聚焦鎖定應(yīng)用于體外樣品整慎。與細胞成像兼容的新發(fā)展依賴于基準點(fiducial)的隨機沉積(deposition)或明場圖像中樣品本身的透射輪廓。然而裤园，當在距離蓋玻片>5μm的深度進行成像時，這些方法在商用軸向聚焦鎖定(通常具有約20nm精度剂府，即Nikon Perfect Focus)上都沒有顯示出明顯的改善，且橫向補償有限(如果有的話)腺占。因此淤袜，盡管熒光成像技術(shù)有望實現(xiàn)高定位精度并增加穿透深度，但它們對三維成像的一般適應(yīng)性仍然有限衰伯。因此铡羡，非常需要一種具有活細胞兼容性、跨微米范圍的絕對三維定位以及精度優(yōu)于任何先前報道的單分子方法的photon-limited定位精度的聚焦方法意鲸。

技術(shù)要點：

基于此，澳大利亞新南威爾士大學的Simao Coelho(一作兼通訊)通過使用雙光子激光直寫來控制樣品中基準點的位置和三維結(jié)構(gòu)來解決這些聚焦限制怎顾，從而在細胞體積的所有維度上實現(xiàn)實時亞納米聚焦(<0.8nm)读慎。并通過整個細胞體積內(nèi)的三維單分子采集和以納米精度進行活細胞單粒子追蹤證明方法的有效性。

圖 1：基準制造和三維聚焦鎖定示意槐雾。a.雙光子激光直寫贪壳。NIR飛秒激光用于觸發(fā)引起光敏材料聚合的化學反應(yīng)。非線性激發(fā)固化焦點處的光敏樹脂蚜退，而其它區(qū)域不受影響。b.三維聚焦鎖定彪笼。在明場照明下钻注，基準點產(chǎn)生干涉圖案(下)配猫，該干涉圖案被獨立的相機以高幀率記錄幅恋。衍射圖案的變化用于監(jiān)測樣品所經(jīng)歷的運動。

實驗結(jié)果：

圖2：用于3D dSTORM成像泵肄、無監(jiān)督數(shù)據(jù)采集和活細胞單分子跟蹤的定制基準

實時亞納米聚焦和動態(tài)聚焦

參考文獻：Coelho, S., Baek, J., Walsh, J. et al. Direct-laser writing for subnanometer focusing and single-molecule imaging. Nat Commun 13, 647 (2022).

DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-022-28219-6

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