樣品的無標(biāo)簽評(píng)價(jià)在制藥和醫(yī)療領(lǐng)域有著各種應(yīng)用避矢，3D細(xì)胞樣品的熒光染色經(jīng)常由于熒光探針無法滲透到組織中而失敗悼瘾。但是可通過在狹縫掃描拉曼顯微鏡中使用貝塞爾束照明來實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞球體的無標(biāo)記觀察和分析，其中貝塞爾束從側(cè)面照射樣品审胸，在分光光度計(jì)的入口狹縫共軛位置產(chǎn)生拉曼散射亥宿，用于高光譜拉曼檢測(cè)。
貝塞爾光束照明拉曼顯微
拉曼顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)可使用貝塞爾光束進(jìn)行側(cè)照明砂沛，如圖1所示烫扼。532 nm的激光器和軸錐棱鏡產(chǎn)生貝塞爾光束，該光束通過NA為0.6的水浸物鏡從樣品側(cè)面引入碍庵。通過NA-0.8水浸物鏡在分光光度計(jì)入口狹縫上成像樣品沿貝塞爾光束產(chǎn)生的拉曼散射映企，通過冷卻ccd相機(jī)獲得高光譜線圖像悟狱，實(shí)現(xiàn)高速拉曼成像，沿y軸平行檢測(cè)400個(gè)拉曼光譜堰氓。物鏡的組合和選擇在一定程度上受到了物理上是否可能將它們放置在裝置中以及可以放置的被觀察樣本的大小的限制挤渐。另外一個(gè)光路來誘導(dǎo)拉曼散射的外延線照明，使用一個(gè)線形焦點(diǎn)双絮，以能夠比較貝塞爾和傳統(tǒng)外延線照明模式之間的成像特性浴麻。使用圖1(a)中的倒立鏡可以切換兩種成像模式。貝塞爾照明的偏振方向設(shè)置為x方向囤攀，使探測(cè)物鏡能夠有效地收集誘導(dǎo)拉曼散射白胀。分光光度計(jì)的狹縫寬度設(shè)為1 Airy單位，使狹縫共聚焦效應(yīng)也可實(shí)現(xiàn)z向的空間分辨率抚岗。光學(xué)裝置的細(xì)節(jié)如圖1所示或杠。
圖一
該顯微鏡的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)是光學(xué)照明點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和檢測(cè)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的乘積。如圖1(b)-(e)所示宣蔚，與外線照明相比向抢，貝塞爾光束照明有效地降低了z方向PSF的延伸，表明貝塞爾照明可以提高軸向分辨率和背景消除胚委。在貝塞爾束成像中挟鸠，旁瓣可能是一個(gè)問題，但在該照明模式中亩冬，入口狹縫減少了旁瓣對(duì)成像的影響艘希，因此是實(shí)現(xiàn)各向同性空間分辨率的關(guān)鍵因素。但是在貝塞爾照明時(shí)硅急，較低的照度物鏡NA導(dǎo)致了較低的x方向空間分辨率覆享。
在狹縫掃描拉曼顯微鏡中使用貝塞爾束照明來觀察厚的生物樣品，并證明了與傳統(tǒng)外延線照明拉曼顯微鏡相比营袜，在觀察球體時(shí)撒顿，圖像對(duì)比度和實(shí)際分辨率的提高。貝塞爾照明和狹縫共聚焦檢測(cè)相結(jié)合的背景還原和各向同性空間分辨率大大提高了拉曼顯微鏡在厚細(xì)胞樣品觀測(cè)中的成像性能荚板。
除了擴(kuò)大拉曼顯微鏡觀察到的樣品范圍之外凤壁，考慮到拉曼散射是一種低效的物理相互作用，通常需要相對(duì)較高的激發(fā)光量跪另，這種技術(shù)還有其他優(yōu)勢(shì)拧抖。特別是在活體生物標(biāo)本中，非侵入性是至關(guān)重要的免绿，設(shè)計(jì)出減少光損傷的方法是很重要的唧席。在外延照明下，貝塞爾照明需要更少的照明功率來獲得相同數(shù)量的拉曼信號(hào)。這有利于減少三維活細(xì)胞成像中的光損傷袱吆，在某些方面，類似于光片熒光顯微鏡所取得的成果距淫。
與高斯光束相比绞绒，貝塞爾光束表現(xiàn)出較強(qiáng)的旁瓣，這使得貝塞爾光束用于側(cè)照時(shí)軸向分辨率降低榕暇。然而蓬衡，結(jié)合狹縫掃描拉曼顯微鏡，狹縫檢測(cè)的共聚焦效應(yīng)可以降低旁瓣對(duì)有效PSF的影響彤枢，如圖1(c)所示狰晚。除了旁瓣外，貝塞爾光束在光束傳播方向的光分布長(zhǎng)度和均勻性方面都比高斯光束有優(yōu)勢(shì)缴啡。因此壁晒，狹縫共聚焦檢測(cè)可以成功地將高斯光束的上述優(yōu)點(diǎn)引入到側(cè)光顯微鏡中。
貝塞爾照明拉曼顯微鏡也有利于提高低濃度樣品的靈敏度业栅，因?yàn)楸尘靶盘?hào)的存在在本質(zhì)上限制了微弱信號(hào)的檢測(cè)能力秒咐。側(cè)邊照明有效地降低了離焦平面的背景信號(hào)，能檢測(cè)出背景貢獻(xiàn)較大時(shí)可能被鏡頭噪聲隱藏的微弱信號(hào)碘裕。由于這種效應(yīng)携取，靈敏度的提高足以擴(kuò)大使用拉曼標(biāo)簽和探針的小分子成像、超多重成像和代謝成像的應(yīng)用范圍帮孔，這些領(lǐng)域的目標(biāo)往往由于靈敏度低而受到限制雷滋。作為一種更通用的原理，低背景拉曼顯微鏡可以在較深的樣品中保持足夠的光譜和空間分辨率文兢，可以擴(kuò)大拉曼光譜在材料晤斩、生物、制藥和醫(yī)療等眾多研究和工業(yè)領(lǐng)域的多功能性姆坚。
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