CRS成像對內(nèi)源性化合物的靈敏度一般在1 ~ 10 mM之間星澳。使用拉曼標(biāo)簽疚顷，通常具有更高的拉曼橫截面旱易，可以將靈敏度提高到~ 100 μ m范圍禁偎。雖然令人印象深刻，但這一檢測限往往高于細(xì)胞內(nèi)小分子和代謝物的濃度阀坏。因此如暖，如果能找到提高靈敏度的方法，CRS顯微鏡的應(yīng)用空間將顯著擴(kuò)大忌堂。
提高相干拉曼成像靈敏度的方法
由于照射到樣品表面的光功率受到樣品損傷閾值的限制盒至，提高CRS顯微系統(tǒng)靈敏度的可行方法就是增加分子響應(yīng)器的有效拉曼截面。對于內(nèi)源性化合物士修，拉曼截面是分子的固有性質(zhì)枷遂，當(dāng)激發(fā)波長遠(yuǎn)離電子共振時，拉曼截面基本上不會改變棋嘲。然而酒唉，對于外部探針，當(dāng)電子共振出現(xiàn)在激勵束的頻率附近時沸移，拉曼截面可以顯著提高痪伦。
共振拉曼散射原理可應(yīng)用到CRS系統(tǒng)的光激發(fā)中侄榴，達(dá)到相應(yīng)提高分子濃度的檢出限的作用。這一方法要求發(fā)色團(tuán)表現(xiàn)出與電子共振良好耦合的振動模式网沾。如受激拉曼散射系統(tǒng)(SRS)所示癞蚕，當(dāng)激發(fā)頻率在電子躍遷附近調(diào)諧時，為熒光標(biāo)記目的開發(fā)的熒光團(tuán)顯示高達(dá)
倍的振動響應(yīng)的出色增強(qiáng)辉哥。結(jié)果是這種熒光探針可以通過CRS工藝在亞微米濃度下檢測到桦山。這是重要的，因為它開辟了在多標(biāo)簽樣品中映射不同探針的可能性醋旦，不同探針的數(shù)量受限于拉曼線的帶寬度苔，而不是熒光的帶寬。由于檢測通道之間的串?dāng)_浑度，在熒光顯微鏡中使用四個以上探針標(biāo)記樣品具有挑戰(zhàn)性寇窑，而在共振增強(qiáng)SRS成像中，多探針標(biāo)記可以擴(kuò)展到數(shù)十個不同的探針箩张。就多重成像而言甩骏，這種能力是一個巨大的勝利，因為許多細(xì)胞生物學(xué)研究需要多個分子參與者的可視化來揭示細(xì)胞內(nèi)的過程和途徑先慷。
通過共振增強(qiáng)SRS提供的多路復(fù)用能力可以進(jìn)一步推動到更低的探針濃度饮笛。通過讓探針選擇性僅由SRS激發(fā)過程決定，原則上可以放寬檢測端的帶寬论熙。這意味著在拉曼躍遷之后福青，分子可以在第②步中被激發(fā)到發(fā)射電子狀態(tài)，允許通過熒光發(fā)射有效地檢測發(fā)色團(tuán)脓诡。如果電子躍遷以成功的拉曼躍遷為條件无午，則可以根據(jù)其狹窄的拉曼帶選擇發(fā)色團(tuán)，同時通過熒光檢測策略提高探測靈敏度祝谚。這一過程被稱為受激拉曼激發(fā)熒光(SREF)宪迟，它使檢測濃度低至單分子限度的分子成為可能，SREF方法結(jié)合了SRS提供的多重成像優(yōu)勢和熒光顯微鏡的高靈敏度交惯，使迄今為止僅使用這兩種技術(shù)都無法進(jìn)行的成像研究成為可能次泽。
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