摘要：雙光子成像已經(jīng)成為神經(jīng)電路光學(xué)監(jiān)測(cè)的一種有用的工具，但它需要較高的激光功率和對(duì)樣本中每個(gè)像素的串行掃描践磅。這導(dǎo)致成像速率慢单刁，限制了對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)等快速信號(hào)的測(cè)量。為了提高雙光子成像的速度和信噪比府适，我們對(duì)雙光子顯微鏡進(jìn)行了簡(jiǎn)單的改進(jìn)羔飞，使用了一個(gè)衍射光學(xué)元件(DOE)，它將激光束分成幾個(gè)小束檐春，可以同時(shí)掃描樣品逻淌。我們通過增強(qiáng)新皮層大腦切片神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢浑p光子鈣成像的速度和靈敏度，證明了DOE掃描的優(yōu)勢(shì)疟暖。DOE掃描可以很容易地提高雙光子和其他非線性顯微技術(shù)對(duì)時(shí)變信號(hào)的檢測(cè)卡儒。
雙光子衍射光學(xué)元件成像
摘要：雙光子成像已經(jīng)成為神經(jīng)電路光學(xué)監(jiān)測(cè)的一種有用的工具，但它需要較高的激光功率和對(duì)樣本中每個(gè)像素的串行掃描俐巴。這導(dǎo)致成像速率慢骨望，限制了對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)等快速信號(hào)的測(cè)量。為了提高雙光子成像的速度和信噪比欣舵，我們對(duì)雙光子顯微鏡進(jìn)行了簡(jiǎn)單的改進(jìn)擎鸠，使用了一個(gè)衍射光學(xué)元件(DOE)，它將激光束分成幾個(gè)小束缘圈，可以同時(shí)掃描樣品劣光。我們通過增強(qiáng)新皮層大腦切片神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢浑p光子鈣成像的速度和靈敏度袜蚕，證明了DOE掃描的優(yōu)勢(shì)。DOE掃描可以很容易地提高雙光子和其他非線性顯微技術(shù)對(duì)時(shí)變信號(hào)的檢測(cè)绢涡。
我們將一個(gè)DOE放置在與物鏡和檢鏡后孔徑共軛的平面上(圖1A)牲剃。這個(gè)元件在光程中被望遠(yuǎn)鏡跟隨，這是確保從DOE出現(xiàn)的小束也在檢鏡處重新連接在一起所必需的雄可，允許每個(gè)單獨(dú)的小束保持準(zhǔn)直凿傅，并微調(diào)-小束傳播的角度。當(dāng)使用偶數(shù)量的波束時(shí)滞项，我們通過機(jī)械阻塞消除了零級(jí)波束狭归。雖然從DOE發(fā)射出的每個(gè)小束都與射入DOE上的激光束的直徑相同，但隨后的望遠(yuǎn)鏡產(chǎn)生了一個(gè)副作用文判，即每個(gè)小束的大小與望遠(yuǎn)鏡的功率成正比。因此室梅，我們用另一臺(tái)望遠(yuǎn)鏡預(yù)先縮小或預(yù)先擴(kuò)大入射激光戏仓。由于我們的系統(tǒng)已經(jīng)在光路的早期使用了望遠(yuǎn)鏡，使光束通過針孔(一個(gè)空間濾波器亡鼠，確保光束截面輪廓的圓度;圖1B赏殃，元素3)，我們利用同樣的望遠(yuǎn)鏡间涵，通過簡(jiǎn)單地改變?cè)撏h(yuǎn)鏡的焦距和第②個(gè)透鏡的位置來預(yù)補(bǔ)償光束的大小(圖1A)仁热。這確保了小波束稍微覆蓋了我們目標(biāo)的后光圈。小束撞擊到檢鏡上并被反射的角度決定了小束在樣品上的空間擴(kuò)散勾哩，這是我們實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)關(guān)鍵變量抗蠢。這個(gè)角度由來自DOE的光束間角(由其相位掩模定義)和DOE與振鏡之間的望遠(yuǎn)鏡功率控制。
在所有的實(shí)驗(yàn)中思劳，我們都使用了DOEs迅矛，它在一條單線上創(chuàng)建了一系列均勻間隔的波束。這個(gè)DOE很容易繞著光路的軸線旋轉(zhuǎn)潜叛，從而沿著任意方向形成一條點(diǎn)線秽褒。在快速掃描中，這種旋轉(zhuǎn)可用于調(diào)節(jié)沿垂直維度的有效波束間角距離威兜。為了增加每像素的光子通量销斟，我們使用了一個(gè)五束小束DOE [SLH-505X-(0.23)-(780)來自StockerYale]，并將小束水平放置以激發(fā)相同的點(diǎn)椒舵，或彼此非常接近的點(diǎn)(圖2蚂踊，頂部)。
在所有使用DOE的實(shí)驗(yàn)中逮栅，我們確保每個(gè)小束都有足夠的功率悴势，能夠充分激發(fā)熒光團(tuán)窗宇。在比較單束和五束成像模式的實(shí)驗(yàn)中，我們將DOE保留在原位特纤，并在兩種實(shí)驗(yàn)中生成5個(gè)小波束军俊，它的區(qū)別是在單束實(shí)驗(yàn)中，我們簡(jiǎn)單地在中間成像平面放置一個(gè)簡(jiǎn)單的虹膜隔膜捧存，作為四個(gè)小波束路徑上的屏障粪躬，只允許一個(gè)通過)翔脱。在這些條件下传泊，在800 nm處，單個(gè)中心光束對(duì)樣品的功率為24 mW支竹，而所有五束光的功率之和對(duì)樣品的功率為108 mW吗货，其他四束的平均功率為21 mW泳唠，每個(gè)都在平均值的5%以內(nèi)。
檢鏡掃描與單光束雙光子光柵掃描成像相同宙搬，并使用放大光電倍增管(PMT)進(jìn)行檢測(cè)(PMT: H7422-P40 Hamamatsu, Bridgewater, NJ, USA;放大器:信號(hào)恢復(fù)AMETEK測(cè)量技術(shù)笨腥，沃金厄姆，英國(guó))勇垛。PMT從來自DOE的多個(gè)小束同時(shí)激發(fā)的所有點(diǎn)收集發(fā)射光脖母。在這種激勵(lì)-促進(jìn)機(jī)制下，波束的水平方向并不是嚴(yán)格要求的闲孤。相對(duì)于感興趣的特征谆级，小的波束間距是關(guān)鍵，然而水平方向是較直接的應(yīng)用讼积。這種成像方式稍微降低了沿小波束方向的成像的空間分辨率肥照，但隨著時(shí)間的推移增加了每個(gè)成像像素的集成強(qiáng)度，因?yàn)槊總€(gè)像素都被采樣了多次币砂，每個(gè)小波束一次建峭。可以通過旋轉(zhuǎn)DOE來改變波束的水平或垂直方向决摧，以保持沿某一特定軸的較大分辨率亿蒸，同時(shí)犧牲沿另一軸的分辨率來獲得增加的信號(hào)。
我們探索了DOE在雙光子成像中的應(yīng)用掌桩，總體目標(biāo)是提高測(cè)量的速度和信噪比边锁。我們利用雙光子成像通常只使用激光產(chǎn)生的一小部分功率來創(chuàng)建多個(gè)具有足夠雙光子激發(fā)的功率的光束，以便更快地激發(fā)一個(gè)完整的成像場(chǎng)并產(chǎn)生更好的信噪比波岛。我們的系統(tǒng)是從雙光子顯微鏡的早期版本發(fā)展而來的茅坛，在該系統(tǒng)中，我們使用DOE將激光束多重化，將谷氨酸釋放到樣品上(Nikolenko等人贡蓖，2007年)曹鸠。我們的裝置包括一個(gè)定制的雙光子掃描顯微鏡，飛秒激光作為激發(fā)源斥铺，一個(gè)傳統(tǒng)的振鏡掃描系統(tǒng)彻桃，一個(gè)PMT或ccd相機(jī)作為探測(cè)器(見“材料和方法”部分;我們測(cè)試了幾種線性DOEs，創(chuàng)建了5晾蜘、11邻眷、16和32個(gè)波束的線性陣列，并探索了兩種通用的掃描策略剔交，將波束水平或垂直定位肆饶，盡管我們也探索了中間位置，如下所示(圖2)岖常。實(shí)際的掃描掃描總是水平方向驯镊，每個(gè)波束都有足夠的功率誘導(dǎo)樣品的雙光子激發(fā)，如果用作單個(gè)激發(fā)源竭鞍，其本身將允許高質(zhì)量的成像阿宅。在水平DOE模式下，在獲取單個(gè)幀的過程中笼蛛，用幾個(gè)小波束激勵(lì)每個(gè)像素，從而有效地增加每個(gè)像素的雙光子激勵(lì)量蛉鹿，隨著時(shí)間的推移而集成(圖2滨砍，頂部面板，“激勵(lì)增強(qiáng)”)妖异。這樣做的一個(gè)后果是由于空間上更大的激勵(lì)譜線惋戏，圖像在水平方向上的空間模糊，盡管這可以較小化他膳，空間分辨率提高响逢，用更窄的波束間距。在垂直DOE模式下棕孙，可以掃描均勻間隔的一系列波束舔亭，這些波束均勻分布在視場(chǎng)的垂直維度上(圖2，底部面板蟀俊，“加速”;參見“材料和方法”部分)钦铺。因此,在一個(gè)系統(tǒng)的n光束,每個(gè)光束必須只蓋一條領(lǐng)土的全部水平方面的高度等于1 / n總高度存在誤傷的觀點(diǎn),從而減少所需的總時(shí)間掃描等于n倍。盡管可以使用PMT或相機(jī)在水平能源部模式,垂直能源部模式需要一個(gè)相機(jī)或其他探測(cè)器有能力解決一些光源的數(shù)量大于等于光束能量來使用肢预。
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