時間聚焦多光子激發(fā)顯微鏡（Temporal focusing multiphoton microscopy）是一種保持深度分辨率同時高度并行多光子顯微鏡。傳統的時間聚焦寬視場配置存在軸向分辨率不佳的問題珊泳。而使用數字微鏡器件(DMD)可實現線掃描的時間聚焦方案鲁冯，對傳統方案優(yōu)化：動態(tài)并行掃描（成像速度）提高軸向分辨率。這種方案可有效提高顯微鏡分辨能力色查。
DMD在雙光子激發(fā)顯微鏡中應用
時間聚焦是一種高度并行的激光激發(fā)技術，廣泛應用于細胞動態(tài)成像秧了、光遺傳學和微制造等領域跨扮。雖然時間聚焦多光子激發(fā)顯微鏡能在寬視場成像，但在軸向分辨率方面?zhèn)鹘y點掃描多光子顯微技術更占優(yōu)勢验毡。一種改進方式是采用線掃描的工作方式衡创，將光線聚焦到線中來對激發(fā)平面進行圖形化，提高軸向分辨率晶通。而使用DMD可以有效實現對光的快速空間調制璃氢，在激發(fā)面形成動態(tài)圖樣。同時由于DMD的圖樣可編程性狮辽，可以控制線寬一也，也可以同時照明多條線，并快速掃過樣品喉脖。這有利于實際實驗中平衡照明區(qū)域和軸向分辨率的不同需求椰苟。
上圖為實驗裝置示意圖。激光束經過反射光柵衍射动看，通過兩個凸透鏡將經過衍射的光束投射在DMD的微鏡陣列上尊剔。由DMD對光束空間調制后菱皆，光束被濾光片反射到物鏡，將DMD圖樣聚焦到樣品中挨稿。
實驗使用綠色熒光量子點樣品比較廣域時間對焦和基于DMD的線掃描時間對焦技術的軸向分辨率仇轻。DMD選取不同寬度的條紋圖樣對比結果，條紋寬度3像素直到全部像素（全亮）奶甘。
寬場時間聚焦激發(fā)(紅點)和線掃描時間聚焦激發(fā)(藍點)的z軸綜合熒光強度分布圖比較篷店。DMD的尺寸為128 × 128像素，寬視場測量為“on”，行掃描模式為128 × 3像素序列為“on”疲陕。數據擬合為洛倫茲函數(實線)方淤。
上圖比較兩種方案在z軸上的分辨能力，線掃描照明的FWHM比寬場照明明顯減少蹄殃，表明線掃描軸向分辨率有提高携茂。
使用花粉顆粒作為樣品比較：
花粉粒的雙光子時間聚焦熒光圖像∽缪遥花粉顆粒的圖像為寬場讳苦、128 × 128 個"開"像素和 8 行 128 × 3 個"開"像素》郧花粉顆粒在Z大熒光強度下由廣域和線掃描模式的圖像分別顯示（a鸳谜，b）。（c） 廣域（黑色）和花粉顆粒上的線掃描（品紅色）模式（a咐扭，b）。通過（c）可得到線掃描模式分辨能力更強滑废。比較（a）（b）草描，還可得知線掃描能夠消除寬場模式的“幽靈”條紋〔哐希“幽靈”條紋不是花粉的圖像特征穗慕，是儀器組件互相干擾產生的現象。
使用DMD的線掃描時間聚焦雙光子激發(fā)顯微鏡相較于傳統的的寬場時間聚焦雙光子顯微鏡妻导，在軸向分辨率方面有明顯提高逛绵。同時由于DMD的高速空間調制性能，可以完成并行線掃描（縮短成像時間）倔韭，并自如根據實際實驗要求平衡視場寬度與軸向分辨率（改變DMD圖樣）术浪。
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