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靈活的同時介觀尺度高速神經(jīng)活動雙光子成像

發(fā)布時間：2022-04-14 14:46:54 瀏覽量：3778 作者：LY.Young 光學前沿

摘要

為了了解大腦作為一個整體如何處理信息和執(zhí)行行為贫悄，有必要以細胞級分辨率監(jiān)測整個大腦的神經(jīng)元活動模式。具有鈣指示劑的雙光子顯微鏡已成為神經(jīng)科學中用于對清醒行為動物的神經(jīng)元群進行功能性在體成像的標準工具娘摔。最近窄坦，新的雙光子顯微鏡的發(fā)展使得能夠?qū)Υ竽X不同區(qū)域中越來越多的神經(jīng)元進行成像。這是通過定制光學元件的設(shè)計和制造實現(xiàn)的，這些元件支持在數(shù)毫米的視野范圍內(nèi)成像鸭津，同時保持細胞級分辨率彤侍。然而，當前使用單焦點激發(fā)的掃描策略需要在成像區(qū)域的數(shù)量和整體采集速率之間進行權(quán)衡逆趋。高達~10Hz的總幀速率已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)盏阶，但是這個幀率限制了可以研究的神經(jīng)元動力學類型闻书。像掃動(whisking)名斟、嗅探(sniffing)、眼球運動(eye movements)和運動(locomotion)這樣的感覺運動(sensorimotor)行為與持續(xù)的神經(jīng)活動關(guān)聯(lián)魄眉，并以4-12Hz的數(shù)量級激發(fā)砰盐。鈣瞬變的解卷積可以將尖峰(spike)事件的時間精度提高到<100毫秒坑律。因此岩梳，要將這些估計的尖峰與行為聯(lián)系起來，采樣率需要處于足夠的奈奎斯特頻率(>30 Hz)晃择。使用多焦點激發(fā)的并行掃描可以在高掃描速度下實現(xiàn)真正的同時多區(qū)域成像冀值。目前，大視場多焦點雙光子顯微鏡通常設(shè)計為具有固定光束分布列疗，以匹配空間排列的檢測方案。這限制了用戶在整個視場中檢測特定感興趣的神經(jīng)元群的能力浪蹂，并限制了由于光散射的空間串擾而在增加的深度上解析熒光的能力作彤。

正文


靈活的同時介觀尺度高速神經(jīng)活動雙光子成像


技術(shù)背景：

為了了解大腦作為一個整體如何處理信息和執(zhí)行行為，有必要以細胞級分辨率監(jiān)測整個大腦的神經(jīng)元活動模式乌逐。具有鈣指示劑的雙光子顯微鏡已成為神經(jīng)科學中用于對清醒行為動物的神經(jīng)元群進行功能性在體成像的標準工具竭讳。最近，新的雙光子顯微鏡的發(fā)展使得能夠?qū)Υ竽X不同區(qū)域中越來越多的神經(jīng)元進行成像绢慢。這是通過定制光學元件的設(shè)計和制造實現(xiàn)的，這些元件支持在數(shù)毫米的視野范圍內(nèi)成像洛波，同時保持細胞級分辨率胰舆。然而，當前使用單焦點激發(fā)的掃描策略需要在成像區(qū)域的數(shù)量和整體采集速率之間進行權(quán)衡蹬挤。高達~10Hz的總幀速率已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)缚窿，但是這個幀率限制了可以研究的神經(jīng)元動力學類型。像掃動(whisking)焰扳、嗅探(sniffing)倦零、眼球運動(eye movements)和運動(locomotion)這樣的感覺運動(sensorimotor)行為與持續(xù)的神經(jīng)活動關(guān)聯(lián)误续，并以4-12Hz的數(shù)量級激發(fā)。鈣瞬變的解卷積可以將尖峰(spike)事件的時間精度提高到<100毫秒蹋嵌。因此，要將這些估計的尖峰與行為聯(lián)系起來葫隙，采樣率需要處于足夠的奈奎斯特頻率(>30 Hz)栽烂。使用多焦點激發(fā)的并行掃描可以在高掃描速度下實現(xiàn)真正的同時多區(qū)域成像勿决。目前伪阶，大視場多焦點雙光子顯微鏡通常設(shè)計為具有固定光束分布，以匹配空間排列的檢測方案逆瑞。這限制了用戶在整個視場中檢測特定感興趣的神經(jīng)元群的能力糟描，并限制了由于光散射的空間串擾而在增加的深度上解析熒光的能力怀喉。


技術(shù)要點：
基于此，美國波士頓大學的Mitchell Clough(一作)和Jerry L. Chen(通訊)提出了一種四區(qū)域大視場雙光子顯微鏡(quad-area large FOV two-photon microscope, Quadroscope)蚓挤，能夠在橫跨約5mm的總視場上實現(xiàn)四個可獨立靶向大腦區(qū)域的視場同時視頻幀率細胞級分辨率成像驻子。作者展示了其在行為相關(guān)時間尺度上測量小鼠感覺運動皮層鈣活性的能力灿意。
(1) 使用兩個獨立掃描引擎實現(xiàn)跨大視場同時成像，兩個掃描引擎使用相似的物鏡和相似的光學組件崇呵，結(jié)合自適應(yīng)光學實現(xiàn)雙區(qū)域成像的分辨率增強缤剧。
(2) 引入基于焦平面單元(focal plane units, FPU)的光束組合域慷，實現(xiàn)成像視場數(shù)的增加荒辕。



a、Quadroscope系統(tǒng)犹褒。激光源由flip mounted mirror(FM)選擇抵窒。激光輸出隨后被50/50分束鏡分成四束(光束1-紅色，2-橙色叠骑，3-綠色，4-藍色)宙枷。每一束光相對于另一束延遲8ns掉房，經(jīng)過擴束鏡(BE)后進入焦平面單元(focal plane units, FPUs)。1/2波片結(jié)合偏振分光鏡(PBS)實現(xiàn)每束光能量的控制慰丛。兩個掃描引擎各自控制兩個成像預(yù)取卓囚。每一個掃描引擎由三個商業(yè)掃描鏡頭(SL1-3)、一個共振掃描儀(resonance scanner)诅病、一個二維掃描反射鏡哪亿、一個定制的掃描鏡頭(SL4)至于合束PBS之前組成粥烁。合束的光進入一個定制的tube lens，隨后進入定制的物鏡(OBJ)锣夹。一個長通二向色鏡(IR/VIS dichroic)用于分離激發(fā)光和發(fā)射光。b银萍、FPU設(shè)計变勇。每一個FPU安裝在一個機械XY位移臺上，包含一個電動可調(diào)鏡頭(electrically tunable lens, ETL)和一個中繼鏡頭贴唇。c搀绣、掃描區(qū)域定位示意圖。四個子區(qū)的每一個能掃描的區(qū)域達~0.75平方毫米戳气。每一個掃描臂有3mm的臂視場链患，在這個臂視場范圍內(nèi)，可以使用FPU來重新定位子區(qū)域瓶您。臂視場可以用二維掃描反射鏡在4.8mm的總視場內(nèi)任意定位麻捻。d、覆蓋在小鼠皮層圖譜上的掃描區(qū)域和視場贸毕。e、四波束的時空復(fù)用夜赵。一個31.25MHz的激光源被分成四束并實現(xiàn)8ns脈沖間隔延遲明棍。探測到的熒光信號隨后被解復(fù)用并分配到每個成像區(qū)域。


實驗結(jié)果：

使用1040nm激光源對清醒小鼠感覺運動皮層中 jYCaMP1s的四區(qū)雙光子鈣成像


附錄：


Quadroscope系統(tǒng)機械設(shè)計


定制掃描鏡頭和tube lens說明


探測系統(tǒng)的光學設(shè)計和分析


參考文獻：Clough, M., Chen, I.A., Park, SW. et al. Flexible simultaneous mesoscale two-photon imaging of neural activity at high speeds. Nat Commun 12, 6638 (2021).
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-021-26737-3


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