Nature Photonics:多光子顯微鏡

正文

引言：

多光子顯微鏡（Multiphoton microscopy,MPM）被認(rèn)為是活體、完整生物組織成像的手段之一洒疚，其成像尺度從分子級別到整個有機(jī)體歹颓。在2010年左右的時間段，被認(rèn)為是侵入和光損傷最小的成像手段油湖，因此適合長時間活體組織成像巍扛，時間尺度從微秒至數(shù)天或數(shù)周》慰可以觀測到固有的詳細(xì)動態(tài)生物過程电湘。多光子顯微鏡相比其它類似光學(xué)成像技術(shù)，之所以有此優(yōu)勢鹅经，是因為它直接使用近紅外飛秒激光生成可見光區(qū)域的可觀測的非線性信號寂呛。近紅外光相比可見光，具有更大的組織穿透深度（生物組織光散射的減少瘾晃，正比于激發(fā)波長的四次方）贷痪。

原理簡介：

（1）當(dāng)同時到達(dá)樣品上的兩個或更多的光子的能量之和滿足熒光基團(tuán)從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)的能量要求時，多光子激發(fā)發(fā)生蹦误。熒光信號可以是進(jìn)入生物樣品的外源探針（Hpechst,AlexaFluor488等）劫拢，也可以是內(nèi)源分子（NAD(P)H或逆轉(zhuǎn)錄熒光蛋白）。

（2）多光子成像對二次諧波（second harmonic generation, SHG）生成敏感强胰，即兩個光子瞬間將它們的能量轉(zhuǎn)移到一個波長減半的光子上舱沧。二次諧波生成不需要熒光基團(tuán)，但要求分子結(jié)構(gòu)是高度有序和特別對稱的偶洋。最常見的滿足二次諧波生成的生物結(jié)構(gòu)是膠原熟吏。

（3）多光子成像是一種非線性的過程，信號產(chǎn)生要求功率密度達(dá)到MW/cm2的量級玄窝。如此量級只有在顯微物鏡的焦平面才可以達(dá)到牵寺，因而將可以觀測的信號限制在了焦平面。這帶來的一個好處是恩脂，焦平面上下的光損傷會大大減小帽氓。飛秒激光有足夠高的峰值功率，并維持一個低的平均功率水平俩块，可以減小生物樣品的光損傷黎休。產(chǎn)生雙光子激發(fā)熒光和二次諧波生成等非線性過程信號的強(qiáng)度正比于激光的強(qiáng)度

DOI：https://doi.org/10.1038/nphoton.an.2010.2

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